特級高鹽稀態釀造醬油中關鍵香氣物質的分析

白佳偉，陳 亮，周尚庭，孫寶國，3，劉玉平，3*

（1.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；2.加加食品集團股份有限公司，湖南 長沙 410600；3.北京工商大學 北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048）

醬油是人們日常生活中重要的調味品，近年來隨著醬油生產企業不斷擴大市場和物流業的快速發展，各地區都有來自全國各地的醬油供消費者選擇。由于各地生活習慣和對食品的口味要求不同，作為發酵調味品的醬油有一定的地域性。雖然生產醬油可以采用不同的生產工藝，但是得到的醬油在香氣特征方面都具有一定的相似性。由于醬油的香氣品質好與壞是衡量其質量的重要指標，所以很多學者研究過醬油的香氣。日本早在1887年就開始研究醬油的香氣[1]，我國在1953年就有了報道醬油香氣成分的文獻[2]。早期對醬油香氣的分析主要是分析其中的揮發性成分，從醬油中鑒定出的揮發性成分已經超過300種[3]，然而并不是每種揮發性成分都對醬油的香氣有貢獻。

從2004年開始有文獻報道結合人的嗅覺來研究醬油的香氣成分[4]，也就是通過氣相色譜-嗅聞儀聯用（gas chromatography-olfactometry，GC-O）從提取物中鑒定出能夠被人的嗅覺感知到的香氣活性成分（odor-active compound，OAC），進而從中確定出對香氣真正有貢獻的關鍵香氣成分（key odorants，KO）。BAEK H H等[4]利用GC-O從醬油的提取物中鑒定出了11種香氣活性成分，其中3-甲硫基丙醛、呋喃酮和醬油酮對醬油的香氣比較重要。SCHIEBERLE P等[5]首次采用分子感官科學的方法研究了日本醬油中的香氣成分，鑒定出30種OACs，通過穩定同位素稀釋分析法進行定量，計算香氣活性值（odor activity value，OAV），篩選出了13種日本醬油中的KO。國內從2009年開始采用GC-O分析醬的香氣成分，從中鑒定出了26種OACs[6]。自2010年以后關于醬油香氣成分的英文文獻多數結合了人的嗅聞，而中文文獻還多數只是進行氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。分析醬油香氣的目的是確定出醬油中的KO，目前從醬油中已經鑒定出來的KO有30多種[5，7-9]。

分析醬油中香氣成分時首先需要將香氣成分從醬油中提取出來，可以采用的方法有溶劑萃取[10]、水蒸氣蒸餾[11]、吹掃捕集[12]、同時蒸餾萃取[13]、固相微萃取[14]、溶劑萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發（solvent extraction-solvent assistant flavor evaporation，SE-SAFE）[5]；在這些方法中，由于SE-SAFE采用溫度低、高真空系統和液氮冷凝，得到的提取物的香氣最接近樣品的實際香氣（水蒸氣蒸餾法和同時蒸餾萃取法需要對樣品進行加熱，會生成一些樣品中不存在的成分；溶劑萃取法得到的提取物中會含有一些不揮發和難揮發性成分，直接進行分析對分析儀器不利；固相微萃取法中起到萃取作用的萃取纖維對揮發性成分具有一定的選擇性；吹掃捕集法吹掃效率受到多重因素的影響，如吹掃溫度、吹掃氣的流速、吹掃時間、捕集效率等），本研究采用SE-SAFE的方法提取市售同級別不同產地的高鹽稀態釀造醬油中的揮發性成分，利用氣相色譜-質譜-嗅聞聯用（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）的方法鑒別其中的KOs，探討同級別醬油之間KOs是否有差別，為鑒別不同級別的醬油和制定相關標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三個醬油樣品都為特級高鹽稀態釀造醬油，樣品1所用原料有水、非轉基因大豆、食用鹽、小麥、酵母抽提物，生產日期為2017-12-05；樣品2所用原料有水、非轉基因脫脂大豆、小麥、食用鹽、白砂糖、谷氨酸鈉、5'-呈味核苷酸二鈉、酵母抽提物、三氯蔗糖，生產日期為2018-03-07；樣品3所用原料有水、非轉基因黃豆、小麥、食用鹽、白砂糖、酵母抽提物，生產日期為2018-02-05。

4-乙基愈創木酚（純度98%）、異丁醇（純度99%）、甲基環戊烯醇酮（純度99%）、正丁醇（純度99.5%）、愈創木酚（純度99%）、異戊醇（純度99%）、羥基丙酮（純度92%）、2,6-二甲基吡嗪（純度98%）、2,5-二甲基吡嗪（純度99%）、乳酸乙酯（純度98%）、2,3,5-三甲基吡嗪（純度98%）、乙酸（純度99.8%）、2-乙?；秽兌?8%）、3-甲硫基丙醛（純度95%）、丙酸（純度99%）、3-甲硫基丙醇（純度98%）、2（5H）-呋喃酮（純度96%）、4-甲基戊酸（純度99%）、苯乙醇（純度99%）、2-乙酰基吡咯（純度98%）、丁酸（純度99%）、2-辛醇（純度99%）、麥芽酚（純度99%）：北京百靈威科技有限公司；異丁酸（純度99%）：紫晶化學科技有限公司；4-乙基苯酚（純度＞97%）、苯甲酸（純度＞99.0%）、苯甲醛（純度＞98%）、糠醇（純度＞98%）、乙基環戊烯醇酮（純度＞97%）、3-甲基丁酸（純度98%）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；醬油酮（純度95%）、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（純度99%）、1-羥基-2-丁酮（純度＞96%），北京華威銳科化工有限公司；苯乙醛（純度95%），上海麥克林生化科技有限公司；呋喃酮（純度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苯乙酸（純度95%）：英國Key Organics公司；乙偶姻（純度97%）、2-乙基-5（6）-甲基吡嗪（純度＞98%）：（北京）阿達瑪斯試劑有限公司；C7～C28正構烷烴（色譜純）：美國Supelco公司；無水硫酸鈉（分析純）、二氯甲烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜-5977A質譜聯用儀：美國安捷侖公司；sniffer3000嗅聞儀：德國Gerstel公司；高真空泵組：英國EDWARDS公司；蝶形玻璃儀器：莘縣京興玻璃器皿有限公司；DKB-501A型超級恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；BF-2000氮氣吹干儀：北京八方世紀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

將醬油100 mL和二氯甲烷50 mL放入玻璃瓶中，在室溫條件下用搖床振蕩1 h，然后將醬油和二氯甲烷分離，得到萃取液（A）和醬油；把分離出的醬油加入玻璃瓶中，再加入二氯甲烷50 mL，重復以上操作，得到萃取液（B），共萃取3次，得到萃取液A、B、C，合并萃取液。使用SAFE將所得萃取液中的揮發性成分與難揮發性成分分離；加熱端水浴溫度為40 ℃，收集餾分一側用液氮冷卻，采用的壓力應低于2.5×10-5mbar，用無水硫酸鈉對收集到的揮發性餾分進行干燥過夜。過濾得到濾液，用韋氏蒸餾柱濃縮至3 mL左右，用氮吹進一步濃縮至1 mL，采用GC-MS-O對所得濃縮物進行分析。

1.3.2 GC-MS-O分析條件

氣相色譜（GC）條件：選用DB-WAX（30.0 m×250 μm×0.25 μm）型毛細管色譜柱；色譜柱起始溫度為40 ℃，在該溫度下保持2 min，之后采用三階程序升溫，第一階以8 ℃/min的速率升至80 ℃，第二階是在80 ℃以4 ℃/min的速率升至100 ℃，第三階是在100 ℃以6 ℃/min的速率升至230 ℃，最后在230 ℃保持5 min；使用氦氣（He）作載氣，其流量為1.66 mL/min；進樣口溫度250 ℃，傳輸線的溫度是250 ℃。

質譜（MS）條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源采用的溫度為230 ℃，四極桿溫度設定為150 ℃，Scan模式進行掃描，掃描范圍為33～350 m/z。

嗅聞（O）條件：經GC分離出成分在色譜柱的末端，以1∶2的比例分別進入MS和O，嗅聞口溫度為220 ℃，采用不分流模式進樣，量為1 μL。嗅聞實驗由3名經過訓練人員進行（實驗前需要進行至少20 h的嗅聞培訓），評價人員在嗅聞口嗅聞流出的香氣，記錄香氣特征和保留時間，每個樣品每位嗅聞人員嗅聞2～3次，2人以上能嗅聞到的香氣給予報道。

1.3.3 定性定量方法

定性分析：通過香氣特征、質譜和保留指數對嗅聞到的香氣成分進行初步定性，然后再分析確定出的成分的標準品，如果香氣特征、質譜和保留指數（retention index，RI）與嗅聞到的成分的一致，則給予報道；如果不一致，不予報道。

定量分析：以2-辛醇為內標（1×105μg/L），采用內標法進行定量。由于質譜作為檢測器對每種成分的響應不同，為了定量結果相對準確，測定了被定量成分與內標2-辛醇的相對校正因子。取相同質量的被定量成分與2-辛醇，用GC-MS-O分析，得到各自的峰面積，則被定量成分與2-辛醇的相對校正因子f可按照下式進行計算：

式中：f表示被定量成分對內標2-辛醇的相對校正因子；f內表示內標的校正因子，S內表示相同質量下內標2-辛醇的峰面積；fx表示被定量成分的校正因子，Sx表示相同質量下被定量成分的峰面積。

被定量成分在樣品中的質量濃度（C）可按照下式計算：

式中：f表示被定量成分對內標2-辛醇的相對校正因子；S1表示被定量成分的峰面積；m表示的是樣品中添加的內標2-辛醇的質量，30 μg；V表示醬油樣品提取液濃縮的體積，1 mL；S2表示內標2-辛醇的峰面積。

1.3.4 OAV的計算方法

OAV即為OACs在醬油中的濃度與其自身閾值的比值；OAV＞1的OACs對醬油的香氣輪廓貢獻大，被確定為醬油的KOs。

2 結果與分析

2.1 三個醬油樣品中鑒定出的香氣活性物質

通過SE-SAFE的方法將三個醬油樣品中的揮發性成分提取出來，利用GC-MS-O對提取物進行分析，所得三個醬油樣品GC-MS分析總離子流色譜譜圖見圖1。對嗅聞到的香氣活性區域進行定性，從3個醬油樣品中共定性出37種香氣活性成分，所得結果見表1。

圖1 三個醬油樣品中揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in 3 kinds of soy sauce samples analysis by GC-MS

表1 三種醬油樣品中香氣活性成分鑒定結果Table 1 Identification results of odor active components in 3 kinds of soy sauce samples

續表

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由表1可知，從3種醬油中共鑒定出香氣活性成分37種，其中樣品1中共鑒定出32種，樣品2中共鑒定出35種，樣品3中共鑒定出30種，3個樣品中共有的香氣活性成分有26種。在37種香氣活性成分中醇類有6種、酸類8種、醛類3種、酮類10種、吡嗪類5種、酚類3種、其他2種。

鑒定出的6種醇類香氣活性物質中包括異丁醇、正丁醇、異戊醇、糠醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇，它們多數都屬于雜醇油的成分，它們是生產醬油過程中所使用的酵母代謝產生的，一般認為有兩種生成途徑：一種是酵母以氨基酸為基質的降解代謝途徑，如亮氨酸經過降解后變成異戊醇，纈氨酸降解后變成異丁醇等；一種是酵母以糖為基質的合成代謝途徑，酵母利用糖通過酮酸路線合成氨基酸，進而合成自身細胞蛋白，其中間體可在α-酮酸酶的作用下經脫羧、脫氫生成相應醇[15]。鑒定出的8種酸類香氣活性物質中包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、3-甲基丁酸、4-甲基戊酸、苯甲酸、苯乙酸，它們在醬油中都曾以揮發性成分被鑒定出來[16]，它們可由游離氨基酸經乳酸菌代謝產生，如甘氨酸產生乙酸、丙氨酸產生丙酸、亮氨酸產生3-甲基丁酸和4-甲基戊酸、纈氨酸產生異丁酸；苯甲酸可由Leuconostoc屬的乳酸菌利用苯丙氨酸產生[17]，它也可能是生產廠家添加的，因為它是我國允許使用的防腐劑，在醬油中的最大用量是1 g/kg；另外在葡萄糖存在下，加熱L-苯丙氨酸可以得到苯乙酸，加熱L-亮氨酸可以得到3-甲基丁酸[18]。鑒定出醛類香氣活性物質有3種，分別是3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛，其中3-甲硫基丙醛和苯乙醛可通過Strecker降解產生，也可以通過酵母的Ehrlich代謝途徑產生，它們的前體物是蛋氨酸和苯丙氨酸[16]；苯甲醛可由乳酸菌通過代謝產生，其前體物也是苯丙氨酸[17]。鑒定出的10種酮類香氣活性物質中有乙偶姻、羥基丙酮、1-羥基-2-丁酮、2-乙?；秽?（5H）-呋喃酮、甲基環戊烯醇酮、乙基環戊烯醇酮、麥芽酚（3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮）、呋喃酮、醬油酮，呋喃酮類物質（如呋喃酮、醬油）即通過還原糖與氨基酸通過美拉德反應產生[19]，也可以通過微生物代謝產生[20]；乙偶姻、1-羥基-2-丁酮、甲基環戊啊烯醇酮和乙基環戊烯醇酮都可通過戊糖與β-丙氨酰組氨酸反應生成[21]。鑒定出來的5種吡嗪類物質分別是2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，主要通過美拉德反應生成[22]。鑒定出來的3種酚類物質是愈創木酚、4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚，它們可通過代謝產生[23]，也可以通過酚酸類物質受熱分解產生[24]。兩種其他香氣活性物質是乳酸乙酯和2-乙?；量?，乳酸乙酯是乳酸菌發酵產生的乳酸與酵母菌發酵產生的乙醇酯化后產生的；2-乙?；量┰谌毡踞u油中被鑒定出來，并且其含量在儲存過程顯著升高[25]。

2.2 三個醬油樣品中鑒定出的香氣活性物質的定量結果

為了對比三個不同廠家的特級高鹽稀態釀造醬油中香氣活性物質的含量，采用內標法對香氣活性物質進行了定量，所得結果見表2。

表2 三種醬油樣品中香氣活性成分定量結果Table 2 Quantitative results of odor active components in 3 kinds of soy sauce samples

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由表2可知，三個樣品中香氣活性物質的總含量有一定差別，也就是說即使都為同一級別的醬油，它們所含香氣活性成分也是不同的，其中樣品1中的香氣活性物質含量最高（達到118 097.98 μg/L），樣品2中的香氣活性物質含量最低（達到87 098.41 μg/L）；并且三個樣品中各類香氣活性成分的含量也有所不同，這應該是導致三個樣品之間香氣有所不同的主要原因。在三個樣品中醇類香氣物質的總含量接近，尤其是樣品1與樣品2（其中樣品1中醇類成分總含量為14 196.44 μg/L，樣品2中醇類成分含量為14 539.71 μg/L），樣品3中糠醇的含量較高，使得樣品3中總醇含量略高；糠醇具有溫和的焦香，它使得樣品3的焦香略強。三個樣品中酸類香氣成分含量有所不同，其中樣品1中酸類物質含量較高（為60 035.52 μg/L），樣品3中酸類物質含量較低（為43 043.75 μg/L）；這些酸類成分中苯乙酸賦予醬油蜜甜香氣，其他酸類成分賦予醬油酸香，其中乙酸可以起到頭香的作用，所以在三個樣品中由于樣品1和樣品2的乙酸含量較高，它們的香氣更透發。三個樣品中醛類物質的含量差別較大，其中樣品3中醛類物質含量最高，醛類物質中又以3-甲硫基丙醛的含量最高（為樣品2的1.5倍，樣品1的2.6倍），由于3-甲硫基丙醛是構成醬香的特征成分，它使得樣品3的煮土豆的香氣強度較大。酮類香氣活性成分在樣品1中的含量最高（為28 659.90 μg/L，為樣品2的2.3倍，樣品3的1.3倍），在樣品2中的含量最低（為12 245.03 μg/L），酮類物質中以麥芽酚和醬油酮的含量主，它們具有典型的焦糖香，這也是樣品1的焦糖香氣強度最大的原因。三個樣品中吡嗪類物質的含量差別較大，其中樣品1中含量最低，樣品2中含量最高（為樣品1的4.8倍，為樣品3的1.9倍），這類物質賦予了醬油一定的堅果香。酚類物質在3個樣品中含量有一定的差別，樣品3中含量較低（1 148.67 μg/L），樣品2中含量較高（2 309.52 μg/L，為樣品3的2倍），酚類賦予醬油煙熏的香氣；采用評香條蘸取醬油，對它們的香氣進行評價時，明顯能夠感覺到樣品3的體香和尾香中煙熏氣息較弱，焦甜氣息更突出。

三個相同級別的醬油在香氣活性物質種類上的差別與香氣活性物質的含量上的不同可能與它們所用原料及生產工藝有關。在原料上，三個樣品都使用了水、非轉基因大豆、食用鹽、小麥、酵母抽提物，其中小麥中的淀粉與麩皮[10]、大豆的種類都會影響醬油的香氣質量[26]；酵母抽提物中含有多種香氣成分[27]，它的香氣質量與用量多少也與醬油的香氣有關系。在生產工藝方面，所用微生物的種類、發酵時間長短[28]、加熱殺菌時間的長短都會影響醬油的香氣[5，24，28]。由于三個樣品來自不同廠家，每個廠家所用原料與生產工藝上的差別可能是導致三個醬油樣品香氣不同的主要原因。

2.3 三個醬油樣品中鑒定出的香氣活性物質的香氣活性值

表3 三種醬油樣品中鑒定出的香氣活性成分的香氣活性值Table 3 Odor activity values of identified odor active components in 3 kinds of soy sauce samples

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由表3可知，除了4種物質的香氣閾值未見文獻報道無法計算它們的OAV外，計算了另外33種香氣活性物質的OAV，有10種香氣成分的OAV＜1，23種香氣成分的OAV＞1；這23種香氣成分是三種醬油樣品中的關鍵香氣成分，對醬油的香氣有貢獻。OAV＞1的23種香氣成分中有15種是三種醬油共有的成分，它們使得三種醬油在香氣屬性上有相似之處；另外8種非共有的成分，使得它們在香氣屬性上又有所不同。

樣品1中OAV＞1的香氣成分有21種，其中OAV＞100的有5種，100＞OAV＞10的有6種，10＞OAV＞1的有10種。樣品2中OAV＞1的香氣成分有19種，其中OAV＞100的有5種，100＞OAV＞10的有4種，10＞OAV＞1的有10種。樣品3中OAV＞1的香氣成分有17種，其中OAV＞100的有4種，100＞OAV＞10的有3種，10＞OAV＞1的有10種。在對三個醬油樣品進行直接嗅聞時會感覺到樣品1的香氣特征與香氣強度與樣品2接近，而樣品3與樣品1和樣品2的香氣特征與香氣強度存在著明顯不同，從OAV的結果可知，樣品1和樣品2中OAV＞10的香氣活性成分在數量和種類上都接近，而與樣品3不同；其中在樣品1和樣品2中OAV＞100的2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，OAV＞50的苯乙醛以及OAV＞1的4-甲基戊酸在樣品3中都沒有被檢測到，使得樣品3的整體香氣相對單薄，酸香較弱，幾乎不能被嗅聞到。

鑒定出來的23種關鍵香氣成分中，值得注意的是醬油酮、3-甲硫基丙醛、異戊醇、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、乙偶姻，它們在醬油中的OAV都＞100，它們對醬油的香氣貢獻最大。醬油酮的沸點較高，它們屬于尾香成分，當采用評香條蘸取醬油嗅聞時，隨著頭香成分和體香成分的揮發，到最后時三個樣品的香氣特征接近，都呈現焦糖香。

從表3的結果可以看出，3種同級別醬油中同一關鍵香氣成分的OAV值有的相差較大，如樣品1中醬油酮的OAV是樣品3中的5倍多，而樣品3中3-甲硫基丙醛的OAV是樣品1中的3倍多，而現行醬油的標準中只是簡單規定特級高鹽稀態發酵醬油應具有濃郁的醬香及酯香[30]，不夠具體，沒有客觀的衡量指標，不便于比較同級別醬油在香氣方面的差別。

3 結論

采用液液萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發的方法提取了3種市售特級高鹽稀態釀造醬油中的揮發性成分，提取物經過GC-MS-O分析，從中共鑒定出37種香氣活性物質，其中醇類有6種、酸類8種、醛類3種、酮類10種、吡嗪類5種、酚類3種、其他類2種。

通過對鑒定出的37種香氣活性物質進行定量分析和計算它們的香氣活性值，23種香氣活性成分的OAV≥1，它們是三種醬油樣品的關鍵香氣物質；其中15種共有成分（包括醬油酮、3-甲硫基丙醛、異戊醇、乙偶姻、愈創木酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈創木酚、3-甲硫基丙醇、麥芽酚、呋喃酮、正丁醇、3-甲基丁酸、苯乙醇、甲基環戊烯醇酮和糠醇）使得三種醬油在香氣屬性上有相似之處，8種非共有成分（包括2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、苯乙醛、丁酸、羥基丙酮、丙酸、4-甲基戊酸、2-乙基-6-甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪）使得它們在香氣屬性上又有所不同。

實驗結果表明同一級別的醬油在香氣活性物質種類和含量上存在差別，關鍵香氣成分也有所不同。為了區別不同級別的醬油，應該制定更具體的評價醬油香氣的標準。