超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定調(diào)味料中5 種罌粟殼生物堿殘留量

寧煥焱，黃秀麗，賴政煬，羅月珍，趙智鋒

（惠州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 惠州 516003）

罌粟殼又名“御米殼”，俗稱“米殼”，為罌粟科植物罌粟（Papaver somniferumL.）的干燥成熟果殼，含有20多種生物堿，以嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、蒂巴因5種異喹啉型生物堿為主，另含D-甘露庚酮糖、赤蘚醇等[1]。罌粟殼因含生物堿，藥理表現(xiàn)有一定的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、止瀉作用，由于罌粟殼的易成癮性[2]，國內(nèi)有不法商販將其加入調(diào)味料中，如火鍋底料、調(diào)料、牛肉湯料等食品中，以達(dá)到吸引消費(fèi)者的目的。消費(fèi)者長期食用含有罌粟殼的食物，對(duì)人體肝臟、腎臟具有毒性損害作用，會(huì)使人成癮、記憶性能衰退，嚴(yán)重可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)造成損傷，甚至呼吸衰竭[3-4]。鑒于此，我國早在2000年已經(jīng)將罌粟殼歸類為“其他毒品”，2008年，中國衛(wèi)生部發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》[5]，罌粟殼就被列為非食用物質(zhì)，嚴(yán)格監(jiān)管，禁止在食品中添加，禁止非法供應(yīng)、運(yùn)輸和使用。

目前，測(cè)定罌粟殼生物堿的方法主要有熒光法[6]、層析法[7]、分光光度法[8]、示波極譜法[9]、酶聯(lián)免疫法[10]、氣相色譜法[11]、液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-17]。其中，前五種方法只能定性和半定量測(cè)定，氣相和液相色譜法因復(fù)雜基質(zhì)易產(chǎn)生假陽性，氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法樣品需衍生化處理，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法因選擇性好、重復(fù)性好、靈敏度高應(yīng)用愈來愈廣泛[16-18]。本研究采用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）預(yù)處理，脫脂去除干擾物。建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定調(diào)味料中5種罌粟殼生物堿的快速分析方法，以期提供一種調(diào)味料中罌粟殼生物堿的高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，為食品安全突發(fā)事件及食品中違法添加監(jiān)測(cè)及分析檢測(cè)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

調(diào)味料（牛肉汁調(diào)味料、調(diào)味料酒、火鍋底料、火鍋蘸料、復(fù)合調(diào)味粉、香辛料調(diào)味油）：市售；乙腈（色譜純）：德國MERCK公司；乙酸乙酯、環(huán)己烷（均為色譜純）：美國Thermo Scientific公司；甲酸（優(yōu)級(jí)純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；固相萃取（solid-phase extraction，SPE）凈化萃取管[150 mg無水硫酸鎂，50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷，（primary secondary amine，PSA），50 mg C18]：美國Agilent公司；嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：美國Stanford Chemicals 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S Micro三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Waters公司；SorvallTMST 16高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher Scientific公司；Synergy超純水機(jī)：德國Merck Millipore公司；XS204分析天平：瑞士MettlerToledo公司；MS3渦旋混合器：德國IKA公司；GT-2227QTS超聲波清洗器：廣東固特超聲股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL、10 μg/mL），置于-18 ℃冷凍保存，用乙腈配制成儲(chǔ)備液，以空白基質(zhì)提取液稀釋成濃度合適的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于棕色瓶中，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品處理方法

稱取均質(zhì)或混勻后樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加5 mL的0.2%甲酸水溶液，渦旋振蕩1 min后，準(zhǔn)確加入10 mL的0.2%甲酸乙腈，密塞，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min，加入3 g無水硫酸鎂、3 g氯化鈉，振搖1 min，以12 000 r/min離心5 min。

取上述離心上清液2 mL，置于5 mL或10 mL四氟乙烯具塞離心管中，4 ℃條件下，加2 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（2∶8，V/V）去除脂肪和磷脂，加無水硫酸鎂、PSA、C18（3∶1∶1）混合粉末0.25 g，渦旋混合1 min，以12 000 r/min離心5 min，去除上層，移取乙腈層，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，待UPLC-MS/MS測(cè)定。

空白基質(zhì)制備：根據(jù)配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的使用量，稱取適量空白基質(zhì)樣品，按上述步驟處理，用于配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：WatersUPLCHSST3（1.7μm，2.1mm×100 mm）；流動(dòng)相：A相：含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，B相：0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～0.5 min，90%A；0.5～1.2 min，90%～60%A；1.2～1.8 min，60%A；1.8～2.5 min，60%～90.0%A；2.5～4.0 min，90%A；4.0～4.5 min，90%～60.0%A；4.5～6.0 min，90%。流速：0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

基于創(chuàng)客教育的第二課堂的主體是大學(xué)生。大學(xué)生因?yàn)榕d趣而自發(fā)參與，經(jīng)過第二課堂的訓(xùn)練，成為具有較強(qiáng)實(shí)踐能力的創(chuàng)客。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（electrospray ion，ESI）源；正離子模式；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；離子源溫度：550 ℃；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：50 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式采集，其他參數(shù)見表1。

表1 5種罌粟殼生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters for five alkaloids of poppy husk

1.3.5 方法學(xué)考察

對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，確保方法可行。以DL=3Sb/S=3Sb×C/X計(jì)算檢出限，并為系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液確認(rèn)各自的線性范圍；以完全等同條件多組測(cè)定（n=6），分析計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證精密度，保證結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性；以低、中、高3個(gè)標(biāo)品添加水平重復(fù)5次計(jì)算測(cè)定加標(biāo)回收率，驗(yàn)證準(zhǔn)確度及靈敏度；使其保持良好置信度和檢驗(yàn)狀態(tài)，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取、凈化方法的選擇優(yōu)化

罌粟堿中5種生物堿通常以鹽酸溶液、酸化乙醇、酸化乙腈、氨化甲醇為提取溶劑。因?yàn)榈侔鸵颉⒛强啥缀醪蝗苡谒捎冒被状继崛∽罱K會(huì)抑制ESI+模式下目標(biāo)化合物的電離，比較研究上述溶液的提取效果，0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑實(shí)驗(yàn)效果理想。

當(dāng)前，針對(duì)罌粟堿生物堿的前處理大部分采用固相萃取小柱凈化，常用的MCX 固相萃取柱除油脂、磷脂效果不佳，HLB固相萃取柱對(duì)小分子干擾物去除不佳，該法試驗(yàn)成本高、操作繁瑣[19-20]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用QuEChERS前處理樣品，低溫條件下經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷（2∶8，V/V）脫脂后，則能達(dá)預(yù)期較好的凈化效果，該法操作簡(jiǎn)便且縮短了檢測(cè)周期。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

5種生物堿分子結(jié)構(gòu)各不相同，嗎啡和可待因分子結(jié)構(gòu)中因帶有酚羥基，極性較強(qiáng)，蒂巴因、那可丁極性較弱。由于選擇質(zhì)譜ESI+模式分析，為使靶標(biāo)出峰快、響應(yīng)好，使用酸性流動(dòng)相。比較研究了5 mmol/L乙酸銨溶液、0.2%甲酸5 mmol/L甲酸銨溶液、0.1%甲酸10 mmol/L甲酸銨溶液分別配比0.1%甲酸甲醇、乙腈6種流動(dòng)相搭配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含0.1%甲酸10 mmol/L甲酸銨-乙腈響應(yīng)理想，色譜分離度、峰型最好。

圖1 5種罌粟殼生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of five alkaloids of poppy husk in a standard solution

比較研究反相色譜柱：Waters UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BHE C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Shim-pack GIS C18（2.0 μm，2.1 mm×100 mm）對(duì)罌粟殼中5種生物堿的分離效果，總離子流圖見圖1。由圖1可知，T3柱在相同梯度洗脫條件下，對(duì)5種化合物的分離度較高、峰形最佳，5 種物質(zhì)5 min內(nèi)全部出峰。5 種物質(zhì)的保留時(shí)間分別為嗎啡（0.90 min）、可待因（2.37 min）、蒂巴因（2.77 min）、罌粟堿（3.05 min）、那可丁（3.38 min），色譜峰分離良好、無拖尾、無叉峰、峰形好。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧正離子模式（ESI+）分析目標(biāo)化合物，根據(jù)5種生物堿的分子結(jié)構(gòu)特征，通過手動(dòng)調(diào)諧和自動(dòng)調(diào)諧相結(jié)合的方式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，選取靈敏度好、豐度高、干擾小的碎片離子作為定性、定量離子，建立多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方法。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍和檢出限

采用空白基質(zhì)制備系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制5種罌粟殼生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到5 種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)R，以信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）=3確定待測(cè)物的檢出限（limit of detection，LOD），SNR=10確定待測(cè)物的定量限（limits of quantitation，LOQ），檢出限和定量限見表2。由表2可知，其中嗎啡、可待因在0.50～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，蒂巴因在0.05～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，鹽酸罌粟堿和那可丁在0.10～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R均＞0.999。嗎啡、可待因的檢出限和定量限分別為3.0 μg/kg、10.0 μg/kg；蒂巴因、鹽酸罌粟堿和那可丁的檢出限和定量限分別為0.6 μg/kg、2.0 μg/kg。

表2 5種罌粟殼生物堿的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)R、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitation of five alkaloids in poppy husk

2.4.2 回收率、精密度試驗(yàn)

調(diào)味品陰性樣品中分別添加低、中、高3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，嗎啡、可待因的添加水平為2.5 μg/kg、25.0 μg/kg、50.0 μg/kg，罌粟堿、那可丁、蒂巴因?yàn)?.5 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg。以基質(zhì)空白工作曲線回歸方程進(jìn)行定量，計(jì)算方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。

表3 5種罌粟殼生物堿的精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision and standard recoveries rate tests of 5 kinds of poppy husk

5種罌粟殼生物堿的平均回收率為65.7%～108.2%，回收率試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.24%～8.71%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%～1.85%。結(jié)果表明，該方法的精密度、準(zhǔn)確度良好，可以滿足調(diào)味品中5 種罌粟殼生物堿的痕量分析測(cè)定要求。

2.4 調(diào)味料中罌粟殼生物堿的檢測(cè)

以超市和農(nóng)批市場(chǎng)所購買的6種不同品種調(diào)味料進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做1個(gè)質(zhì)控樣品，應(yīng)用該方法分別檢測(cè)5種罌粟殼生物堿，結(jié)果見表4。由表4可知，火鍋底料有檢出，呈陽性，復(fù)檢做平行樣取平均值，該火鍋底料做質(zhì)控樣并以表3對(duì)應(yīng)添加水平計(jì)算其含量，其余5種樣品呈陰性，表明調(diào)味品中仍存在非法添加現(xiàn)象，未來將進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍，為監(jiān)管提供技術(shù)保障。

表4 不同品種調(diào)味料中5種罌粟殼生物堿含量的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Determination results of five alkaloids of poppy husk contents in different kinds of seasonings μg/kg

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)調(diào)味品中5種罌粟堿的分析方法，在提取和凈化過程中采用QuEChERS 前處理方法，乙酸乙酯-環(huán)己烷（2∶8）脫脂，有效去除了雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)優(yōu)化了儀器檢測(cè)參數(shù)，提高了檢測(cè)的靈敏度。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%～1.85%，回收率在65.7%～108.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%～8.71%，表明該方法精密度及準(zhǔn)確度良好，檢測(cè)速度快，適用于調(diào)味品中非法添加罌粟殼的定性定量檢測(cè)，能為大批量檢測(cè)保駕護(hù)航，同時(shí)，為食品安全監(jiān)管工作提供技術(shù)支持和參考。