玫瑰花茶中原花青素檢測方法研究

張 洪，楊昌彪，楊鴻波，龍昭航，李占彬*

（貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014）

玫瑰花茶（rose tea）是玫瑰花（Rosa rugosa）采摘后，經適當折瓣、攤放，去除花蒂、花蕊及其他雜質，以凈花瓣和茶葉窨而制成[1]。玫瑰花含有氨基酸、黃酮類、多酚類及色素類等多種生物活性成分[2]，同時富含香茅醇、香葉醇及芐醇等多種揮發性香氣成分[3]，因此，玫瑰花茶具有通經絡、活血補血、護膚美容、助消化、抗氧化等作用[4]，又因其香氣甜美，成為最受歡迎的花草茶之一。原花青素（procyanidins）是一類由不同數量的單體黃烷-3-醇縮合而成的聚多酚類物質，單體含有典型的C6-C3-C6黃酮結構，也屬于黃酮類化合物[5-6]，其代謝產物為兒茶素和表兒茶素，具有清除自由基的功能和較強的抗氧化作用[7]，是一類多酚天然抗氧化劑[8]，玫瑰花中含有豐富的原花青素。

目前，原花青素的檢測方法主要有薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高效液相色譜-質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法及核磁共振法等[9-13]，雖然這些方法對原花青素的分離效果好，檢測結果準確性高，但在生產中成本投入大，操作不方便。紫外分光光度法因其簡單易行、快速準確，已應用于藍莓[14]、藍靛果[15]等產品中原花青素含量的檢測，而應用于玫瑰花茶尚未見報道。此外，均勻試驗設計與正交試驗設計聯用的方法在產品加工工藝優化試驗中已有廣泛應用[16-17]，但應用于檢測方法的研究與開發的報道卻較少。

本研究擬采用紫外分光光度法檢測玫瑰花茶中的原花青素，以乙醇作為提取溶劑[18]，硫酸鐵銨催化比色[19-20]，選取影響玫瑰花茶中原花青素檢測的因素，采用均勻試驗設計初步優化原花青素檢測條件，在此基礎上，采用正交試驗進一步優化檢測方法，為玫瑰花茶中原花青素的分析檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花茶：貴州省貞豐縣；原花青素標準品：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、丙酮：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇：重慶川東化工（集團）有限公司；鹽酸：國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇：成都市科隆化學品有限公司；十二水合硫酸鐵（Ⅲ）胺：上海沃凱生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV1901PC型紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；SK250HP型超聲波清洗機：上?？茖С晝x器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋：金壇市恒豐儀器制造有限公司；BSM220.4型電子天平：上海卓精電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素檢測波長的選擇

準確稱取5.0 mg原花青素標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得到質量濃度為0.5 mg/mL的標準儲備液，避光保存[21]。準確移取1.0 mL原花青素標準儲備液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，采用紫外可見分光光度計在波長200～800 nm范圍內對其進行掃描，確定原花青素的最大吸收波長。

1.3.2 原花青素標準曲線繪制

準確吸取0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL原花青素標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙醇-鹽酸-水溶液（50∶0.1∶49.9，V/V）定容，配制質量濃度分別為0、0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.100 mg/mL、0.150 mg/mL、0.200 mg/mL的原花青素標準溶液。取6支10 mL具塞試管，分別加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液[22]，1 mL標準系列溶液及0.2 mL 0.04 mol/L硫酸鐵胺溶液，搖勻，沸水浴10 min，冷卻平衡10 min，在最大吸收波長處，用紫外可見分光光度計測定吸光度值。以原花青素質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制原花青素標準曲線。

1.3.3 玫瑰花茶中原花青素含量的檢測

稱取0.2 g（精確至0.001 g）經粉碎的玫瑰花茶樣品，置于50 mL具塞試管中，加入乙醇-鹽酸-水溶液30 mL，超聲提取，室溫冷卻，轉移至50 mL容量瓶中，用該乙醇-鹽酸-水溶液定容，過濾，制成試樣溶液。在10 mL具塞試管中加入6mL正丁醇-鹽酸溶液，加入1mL試樣溶液及0.2mL0.04mol/L硫酸鐵胺溶液，搖勻，沸水浴，冷卻平衡，在最大吸收波長處，用紫外可見分光光度計測定吸光度值，通過標準曲線計算出試樣溶液中原花青素的質量濃度，從而計算出玫瑰花茶中原花青素的含量。

1.3.4 均勻試驗初步優化原花青素含量的檢測方法

以原花青素含量（Y）為評價指標，選擇乙醇-鹽酸-水溶液中乙醇體積分數（X1）、鹽酸體積分數（X2）、超聲提取時間（X3）、沸水浴時間（X4）、平衡時間（X5）為考察因素，采用U9（95）均勻試驗初步優化原花青素含量的檢測方法。

1.3.5 正交試驗設計優化原花青素含量的檢測方法

在均勻試驗的基礎上，以原花青素含量（Y）為評價指標，乙醇體積分數（A）、鹽酸體積分數（B）、超聲提取時間（C）為考察因素，采用L9（34）正交試驗優化原花青素含量的檢測方法。

1.3.6 加標回收率試驗

根據最佳檢測條件，制備3份玫瑰花茶試樣溶液，分別加入15 mg/g、30 mg/g、45 mg/g原花青素進行加標回收率試驗，將加標樣原花青素含量與未加標樣原花青素含量進行比較，計算回收率[23]，其計算公式如下：

式中：p為回收率，%；c1為未加標樣提取液的原花青素含量，mg/g；c2為加標樣提取液的原花青素含量，mg/g；c3為加標量，mg/g。

1.3.7 玫瑰花茶樣品分析及精密度試驗

采用最佳條件下檢測6個玫瑰花茶樣品中原花青素的含量，計算原花青素含量及其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結果與分析

2.1 原花青素檢測波長的選擇

紫外可見分光光度計在波長200～800 nm處對原花青素掃描的結果見圖1。由圖1可知，原花青素在波長550 nm處有最大吸光度值，因此，確定最佳測定波長為550 nm。

圖1 原花青素紫外吸收波長的掃描結果Fig.1 Scanning results of ultraviolet absorption wavelength of proanthocyanidins

2.2 原花青素標準曲線的繪制

圖2 原花青素的標準曲線Fig.2 Standard curve of proanthocyanidins

原花青素的標準曲線見圖2。由圖2可知，原花青素的標準曲線方程為y=4.972 4x-0.002 4，相關系數R2=0.999 9，表明原花青素在質量濃度0～0.200 mg/mL范圍內，線性關系良好，可以用于原花青素含量的測定。

2.3 均勻試驗優化結果

U9（95）均勻試驗設計與結果見表1，方差分析見表2。

表1 均勻試驗設計與結果Table 1 Design and results of uniform tests

表2 均勻試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of uniform tests results

對表1的結果進行多元線性逐步回歸分析，得到乙醇體積分數（X1）、鹽酸體積分數（X2）、超聲提取時間（X3）、沸水浴時間（X4）、平衡時間（X5）對原花青素含量的二次回歸模型：Y=15.02-0.056 22X1X2+0.003 279X1X3。

由表2可知，回歸模型的P值=8.516 3×10-7＜0.01，極顯著。由回歸方程可知，X1與X2、X3存在交互作用，X4、X5對Y的影響非常小，對回歸方程進行規劃求解，得出玫瑰花茶中原花青素的檢測條件為乙醇體積分數（X1）50%、鹽酸體積分數（X2）0.1%、超聲時間（X3）90 min、沸水浴時間（X4）為10 min、平衡時間（X5）為10 min。

2.4 正交試驗優化結果

在均勻試驗的基礎上，選取乙醇體積分數（A）、鹽酸體積分數（B）、超聲提取時間（C）為考察因素，原花青素含量（Y）為評價指標進行L9（34）正交試驗，正交試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

由表3極差分析可知，各因素對玫瑰花茶中原花青素檢測的影響主次順序為乙醇體積分數（A）＞鹽酸體積分數（B）＞超聲提取時間（C），最佳檢測條件為A2B2C3，即乙醇體積分數50%、鹽酸體積分數0.10%、超聲提取時間110 min。由表4可知，乙醇體積分數對原花青素檢測結果影響顯著（P＜0.05），鹽酸體積分數、超聲提取時間影響不顯著（P＞0.05）。故玫瑰花茶中原花青素檢測的最佳條件為乙醇體積分數50%，鹽酸體積分數0.10%，超聲提取時間110 min，沸水浴時間10 min、平衡時間10 min。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Design and results of orthogonal tests

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

2.5 加標回收率試驗結果

加標回收率試驗結果見表5。由表5可知，在最佳檢測條件下，玫瑰花茶中原花青素的平均加標回收率為102.1%，RSD為3.64%，說明方法穩定可靠，準確度良好。

表5 原花青素的加標回收率試驗結果Table 5 Results of standard recovery rate tests of proanthocyanidins

2.6 樣品分析及精密度試驗結果

在最佳檢測條件下，6份相同玫瑰花茶的原花青素含量測定結果見表6。由表6可知，RSD為1.56%，表明該方法具有較高的精密度。經檢測，玫瑰花茶中原花青素平均含量為28.06 mg/g。

表6 玫瑰花茶中原花青素含量的測定結果Table 6 Determination results of proanthocyanidins content in rose tea

3 結論

運用均勻設計與正交設計聯用法建立紫外分光光度法測定玫瑰花茶中原花青素含量的檢測方法，最佳檢測條件為乙醇體積分數50%，鹽酸體積分數0.10%，超聲提取時間110 min，沸水浴時間10 min，平衡時間10 min，該檢測方法的加標回收率（102.1%）和精密度試驗結果（1.56%）良好，靈敏穩定、操作簡便。在此最佳條件下，測定玫瑰花茶中原花青素平均含量為28.06 mg/g。