小鼠CD147過表達對皮膚毛發生成和創傷修復的影響*

胡興旺，謝雅琳，龍娟，周磊，陳旺青，鄧智利

（中南大學湘雅醫院 1.感染病科/病毒性肝炎湖南省重點實驗室；2.皮膚科/銀屑病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410008）

CD147（cluster of differentiation 147）又名細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族的一種多重糖基化修飾的單次跨膜蛋白，相對分子質量約50～60 kDa［1］。CD147 于心血管系統、神經系統、免疫系統和皮膚等器官中的多種細胞中廣泛表達；也可以通過剪切從細胞膜脫落下來，或通過微囊泡分泌從而游離進入組織液和血液［2］。作為1 型整合膜受體，可以與親環素、PfRh5、整連蛋白等結合，參與細胞間的識別、免疫調節、器官發育、病毒感染等多種生物學過程［3］。例如：CD147 可以通過核轉錄因子-kB（nuclear transcription factor kappa B, NF-kB）信號通路調節α4 整連素表達從而影響免疫細胞的黏附和識別［4-5］。通過調節下游基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）基因，在精子發生過程中影響生殖細胞的遷移、生存或凋亡［6］，通過調節單羧酸轉運體（monocarboxylate transporters,MCTs）影響乳酸轉運［7］。

在腫瘤中，CD147 與多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等的發生、發展、病理分級、治療預后密切相關。其機制主要涉及3 個方面，首先CD147 作為MMPs 上游強力誘導因子作用于整合素α3β1、絲裂原活化蛋白等，極大提高MMPs 酶的水平和活性，提高基底膜和細胞外基質降解速率，大幅促進腫瘤的增殖和侵襲［8］。其次，它可通過PI3K-AKT 等多種途徑誘導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）產生，促進腫瘤血管生成［9］。最后可以通過調節糖酵解等代謝途徑促進腫瘤的發生［10］

CD147 在皮膚細胞尤其是表皮角質形成細胞中高表達，CD147 在白細胞介素22（interleukin 22, IL22）誘導的皮膚銀屑病［11］、系統性紅斑狼瘡［12］中起關鍵作用。在皮膚腫瘤中，CD147 可通過調節葡萄糖轉運，參與黑色素瘤細胞生存和增值［13］。抑制CD147 后可以降低胰島素樣生長因子結合蛋白 2 （insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2）表達從而誘導黑色素瘤細胞的凋亡［14］。細胞核定位的CD147 可以通過與RING1相互作用抑制其轉錄活性從而抑制黑色素瘤細胞的遷移能力［15］。TRAF6 可以通過抑制CD147 的泛素化，促進其在細胞膜上的招募和定位［16］，從而參與表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor,EGFR）信號通路激活［17］，促進了黑色素瘤細胞的侵襲和轉移能力。因此諸多證據都提示抑制 CD147 可以作為開發新的黑色素瘤治療策略的靶標基因［18］。

最新研究表明 CD147 與干細胞存在密切聯系，如 CD147 可被人胚胎干細胞抗體識別，是干細胞的潛在標志基因［19］。有證據證實，CD147 的表達水平與角質形成細胞的分化程度呈負相關［20］。干擾 CD147 表達后，皮膚角質細胞分化標志基因角蛋白 keratin10 表達上調［21］。筆者的前期研究發現CD147 的表達與毛囊活動相關，提示CD147 可能在皮膚毛發生成和皮膚干細胞穩態中扮演重要角色，因此本研究構建了 CD147 過表達小鼠，并對CD147過表達后的小鼠皮膚毛發生成和皮膚創傷修復能力進行了觀察，研究結果顯示 CD147 改變毛發形成的模式，并削弱皮膚創傷修復能力。這一研究為更好地理解和闡明 CD147 在皮膚中的功能提供了現實依據，也為開發以 CD147 為靶標的皮膚外用藥物提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

CD147 抗體 （貨號 sc-9757） 購自 Santa Cruz,CD34+抗體（貨號 14-0349-82）購買自 eBioscience,DAPI （貨號 28718-90-3）、BrdU （貨號 19-160）和抗 BrdU 抗體 （貨號 B8434） 購自 Sigma。熒光二 抗 Alexa Fluor?488 （貨 號 A-10684）、 Alexa Fluor?555 （貨號 A-21432）購買自 Invitrogen。

CD147 過表達轉基因小鼠委托上海南方模式動物所構建，采用受精卵注射隨機插入的技術方案將外源 CAG 啟動子驅動的鼠源 CD147 基因片段導入小鼠中，經過鼠尾 DNA 提取和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR） 法鑒定篩選建系，獲得全身穩定過表達 CD147 小鼠品系。動物繁殖與試驗在中南大學實驗動物中心進行，所有操作均經過中南大學湘雅醫院倫理委員會審批并遵從相關動物倫理條例。

1.2 實驗方法

1.2.1 體重、身長測量 小鼠出生開始，每天使用托盤天平進行稱重，并使用軟尺測量身長增長情況（鼻尖至尾尖）。16 d 測量完畢后，取鼠尾提取 DNA，進行 PCR 基因型鑒定，并依照鑒定結果對測量數據進行分類和分析。

1.2.2 皮膚組織石蠟包埋和 HE 染色 取 0.5 cm2背部皮膚組織，4% 多聚甲醛固定 24 h，按照標準程序經過梯度乙醇脫水、透蠟后石蠟包埋，組織切片機中0.8 m 厚度切片。組織薄片攤片機展開后吸附于陽離子處理的載玻片上，晾干保存。HE 染色前，取出60℃烘烤2 h，二甲苯或松節油脫蠟2 次每次10 min，梯度乙醇復水后蘇木素溶液染色數分鐘，流水適當沖洗后氨水反藍，隨后梯度酒精脫水伊紅染色1 min，無水乙醇清洗后二甲苯透明，最后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 小鼠多輪脫毛 小鼠脫毛后干細胞激活，7 d后小鼠毛發完全進入生長期。21 d 后進入靜息期。因此以28 d 為一個周期，對實驗小鼠進行9 輪脫毛。小鼠經麻醉后，使用毛刷按照小鼠背部毛發生長方向將融化的液態石蠟均勻地刷布于整個背部。室溫冷卻約3 min 后石蠟凝固，從尾部開始逆毛發生長方向輕輕撕扯，背部毛發即可隨石蠟剝脫。如局部毛發脫不干凈，可重復以上操作一次。

1.2.4 創傷實驗 小鼠腹腔注射麻醉劑麻醉后，按照上述方法對背部皮膚進行脫毛，隨后使用酒精和絡合碘清潔消毒裸露皮膚。使用6 mm 直徑孔徑打孔器進行創傷造口。最后分別于創傷造口之后的1，3，5，7，9，11 d 使用游標卡尺對皮膚傷口直徑進行測量并統計分析，非圓形傷口直徑定義為（長+寬）/2。

1.2.5 冷凍切片與免疫熒光染色 采集0.5 cm2小鼠皮膚組織，PBS 洗凈后浸入OCT 冰凍包埋劑中平衡5 min。轉移到0.2 mm 中性濾紙上展平，隨后在制作好的模具中OCT 冷凍包埋。Leica CM1520 冷凍切片機行10 μm 厚度切片，展片后陽離子載玻片吸附，-80℃保存。免疫熒光染色時，取出冷凍切片，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，隨后0.2% TritonX-100 室溫通透20 min，PBS 浸洗，正常山羊血清室溫封閉、依次孵育目標蛋白一抗和針對性熒光二抗，并中間洗滌。使用DAPI避光復染細胞核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統計學方法

本研究所有數據均采用Prism 6.0 軟件進行統計分析，顯著性差異采用Student's T-test 進行校驗，P＜0.05 為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 CD147 過表達對小鼠生長發育和皮膚結構無顯著影響

為了從整體上觀察CD147 對小鼠有何影響，構建 CD147 過表達小鼠后，對鑒定陽性的小鼠基礎表型進行了觀察。結果顯示 CD147 基因的過表達小鼠外觀、體型、行為模式與野生型（wild type,WT）小鼠無明顯差異。通過對出生后體重和身長發育情況進行逐天測量，測量數據進行回歸統計分析繪制時間曲線 （圖1A）。結果顯示，過表達小鼠在體重增長和身高（身長）增長上與野生型小鼠無顯著差異。隨后取 8 周齡離乳小鼠皮膚，組織經固定后，石蠟包埋并切片進行 HE 染色（圖1B），結果顯示皮膚結構上兩者亦無顯著差異。這一結果證明 CD147 基因的過表達并不影響動物的早期發育和皮膚結構形成。

2.2 CD147 過表達影響小鼠毛發類型分布

小鼠毛發的形態包括三類，分別為粗大直立型的剛直毛（Guard 型毛，以下簡稱 G），形似括號的弧線形毛（Bow 型毛，以下簡稱 B）和具有多個彎曲轉折的 Z 字型絨毛（Zigzag 型毛，以下簡稱Z）。筆者對模型小鼠皮膚毛發進行了取樣分析，取 1、5、8 個月齡小鼠，背部隨機拔取 3 撮毛發，在奧林巴斯體式顯微鏡和 DP80 成像分析系統下對毛發樣本進行分類計數和長度測量，結果如圖2所示，CD147 過表達小鼠與同窩野生型小鼠毛發相比，內部環狀結構排列偏混亂 （圖2A），但各類型毛發長度差異無統計學意義 （圖2B），其長度-年齡曲線（圖2C）顯示 CD147 過表達后毛發偏短，但是隨著年齡增大逐漸無差異，提示著CD147 可能對維持毛囊長期穩態有一定影響。毛發類型分類統計顯示各型毛比例變化，剛直毛數量減少，Z 型絨毛比例增多（圖2D），提示 CD147可能在毛發形成中具有作用。

2.3 多輪脫毛后 CD147 過表達小鼠毛發相對野生型稀疏

為了進一步觀察 CD147 過表達對毛囊和毛發的影響，筆者采取了多輪石蠟脫毛的方法 （圖3A）造成毛囊損傷，刺激毛囊激活，反復進入生長期。對脫毛后小鼠拍照，并取脫毛后 0、2、7 d小鼠皮膚組織，冷凍切片和 Ki67 免疫熒光染色觀察毛囊細胞增殖情況，結果顯示從脫毛后2d開始毛囊中細胞增殖標記基因 Ki67 表達開始激活，到7 d 達到高峰（圖3B）。經過 9 輪脫毛刺激后，皮膚鏡掃描顯示 CD147 過表達小鼠相對于野生型對照毛發更稀疏（圖3C），提示 CD147 過表達降低皮膚毛發再生能力。

圖1 CD147 過表達小鼠生長發育情況和皮膚結構觀察

圖2 CD147 過表達小鼠毛發分類觀察

圖3 多輪脫毛降低CD147 過表達小鼠毛發密度

2.4 多輪脫毛后CD147 過表達小鼠創傷愈合能力降低

接下來筆者觀察了野生型（WT） 小鼠和CD147 過表達小鼠多輪脫毛后皮膚創傷愈合能力的改變。使用6 mm 直徑創傷打孔器進行創傷。并分別在創傷之后的第3，5，7，9，11 d 對小鼠背部傷口進行觀察和測量（圖4A）。傷口直徑相對于初始直徑（6 mm）計算出修復百分比，并對各時期CD147過表達組和對應對照組數據進行t檢驗。統計結果如圖4B所示，相對于野生型小鼠，多輪脫毛后的CD147過表達小鼠的皮膚創傷修復減慢。

圖4 多輪脫毛后 CD147 過表達小鼠創傷修復能力降低

2.5 CD147 過表達促進皮膚干細胞激活和毛囊細胞增殖

為了從分子水平上更好地分析多輪脫毛對皮膚毛囊的影響，筆者收集多輪脫毛后的小鼠皮膚組織，進行冷凍切片后皮膚干細胞的標志基因CD34 免疫熒光染色。結果如圖5A 所示，經過多輪脫毛后，相對于野生型WT 對照，CD147 過表達小鼠在皮膚局部毛囊中CD34 陽性的細胞更多，提示皮膚干細胞被激活增殖，數量增加。同時通過腹腔注射小分子標記物BrdU（5 mg/kg）后，1 h后收集皮膚，同樣冷凍切片并使用BrdU 抗體免疫熒光染色，結果顯示多輪脫毛后相對于野生型WT對照，CD147 過表達小鼠在皮膚局部單個毛囊中細胞增殖更加活躍（圖5B）。

圖5 免疫熒光檢測脫毛后小鼠皮膚

3 討論

CD147 是一個多功能分子，在胚胎發育、神經系統功能、損傷修復、炎癥發生、腫瘤進展等多種生理病理過程中均發揮重要作用。它作為一個細胞表面受體糖蛋白，在皮膚角質細胞中強表達，并定位于細胞膜。然而它在皮膚毛囊中的作用目前仍然少見報道。有證據表明CD147 在皮膚毛囊根部毛球區和隆突區高表達［22］，與毛囊干細胞分布區域重疊。毛囊干細胞在皮膚毛發再生、創傷修復和皮膚穩態維持中起重要作用，其分裂和增值分化形成新的皮膚角質形成細胞，對于維持皮膚屏障功能至關重要。在毛發的生長和消退周期中，皮膚干細胞也周期性地激活和短暫擴增。筆者的研究數據證實CD147 過表達后，可促進皮膚中干細胞的激活和細胞增殖，提示CD147 表達對于皮膚毛囊干細胞具有調控作用。它的過表達可以引起皮膚毛發形成的改變。然而為何CD147過表達后皮膚毛囊干細胞增殖增加，皮膚創傷的修復能力反而降低呢？筆者推測多輪脫毛后，毛囊和其中的干細胞反復激活，在CD147 的作用下，這種長期的增加增殖可能加速了皮膚干細胞的耗竭，最終導致毛囊數量的減少，毛發變稀疏。而干細胞的耗竭最終導致了皮膚修復功能的減弱。

然而CD147 通過什么途徑來調節和影響皮膚干細胞功能仍然有待進一步挖掘，有線索表明，CD147 定位于線粒體內膜，可能參與調解呼吸代謝作用。并且CD147 可以通過Glut1［13］、MCT4［10］等途徑調控細胞糖酵解。由于皮膚干細胞通過減少有氧呼吸來達到降低氧化水平、保護遺傳物質、降低氧化損傷和維持細胞自我更新。因此筆者推測CD147 可能通過調節能量代謝的方式來影響皮膚干細胞的數量和功能。

當然本研究也存在不少局限之處，首先，作為表型觀察研究，對于CD147 如何調節毛囊干細胞的潛在分子機制挖掘不夠深入；其次，統計標本量和實驗動物數量有限，可能存在一定抽樣偏差。最后，作為CD147 過表達小鼠模型，與人體真實生理狀況存在一定差異，因此CD147 與毛囊的關系及其過表達后在人體內真實生理狀態變化仍需進一步研究確認。

CAG 啟動子是一種由人工構建的廣譜表達的組合啟動子，由巨細胞病毒（cytomegalovirus,CMV）早期增強子和雞β-肌動蛋白啟動子組成，其驅動的外源基因可表達于小鼠各組織細胞。筆者構建的CAG-CD147 過表達小鼠經過驗證，可在皮膚細胞中維持高水平CD147 表達。因此，綜上所述，通過觀察CD147 過表達后毛發的生成、多次脫毛后毛發的再生情況、創傷的愈合和皮膚毛囊干細胞的激活，筆者發現并證明CD147 過表達后，可能促進皮膚中干細胞的激活和細胞增殖，這種長期的激活可能加速了皮膚干細胞的耗竭，最終導致毛囊數量的減少，毛發變稀疏和皮膚修復功能的減弱。這一研究不僅為理解和闡明CD147 在皮膚中的功能提供了現實依據，也為開發以CD147 為靶標的皮膚外用藥物提供理論指導。