胰腺癌中磷脂酶Cε1和B淋巴細胞瘤-2表達的研究

徐懿，宋堃

（中南大學湘雅醫(yī)院1.眼科；2.普通外科，湖南長沙410008）

胰腺癌作為消化道腫瘤中致死率極高的腫瘤之一，在癌癥人數(shù)中排名第四位［1］。胰腺癌的危險因素很多；由于其起病隱蔽，患者在早期因無癥狀鮮少于醫(yī)院就診，使胰腺癌早期檢出率極低。雖然經(jīng)過多年的基礎與臨床研究，但晚期胰腺癌的預后仍然差強人意。

PLCε1 作為磷脂酶C（phospholipase C, PLC）蛋白家族中的不可忽視的部分，對于磷酸肌醇為基礎的信號轉(zhuǎn)導具有不可或缺的作用。研究證實PLCε1 參與磷酸肌醇信號通路的調(diào)控，水解磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2）后生成三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）和二酰甘油（diacyl glycerol,DAG），二者作為細胞信使參與信號通路和相關(guān)細胞機制的調(diào)節(jié)［2］。同時，PLCε1 可通過IP3活化鈣離子通路信號，并在生成DAG 后激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）從而進一步參與調(diào)控細胞的增殖、應激和凋亡。凋亡機制在器官成熟、人體發(fā)育的過程中有非凡的意義［3］。凋亡是機體清除腫瘤的一種重要方式。凋亡機制受到眾多基因、蛋白、micRNA 的調(diào)控，該機制的平衡被打破，如促進腫瘤凋亡可以抑制腫瘤生長，反之則誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生。針對凋亡機制相關(guān)的調(diào)控基因，人們已經(jīng)展開了對B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）家族基因的許多研究，而Bcl-2 是抑制凋亡的重要蛋白［4］。Bcl-2 主要參與線粒體凋亡途徑（內(nèi)源性凋亡途徑）的調(diào)控，抑制凋亡［5］。凋亡的始動分子BAK、BAX 是BH3 結(jié)構(gòu)域蛋白的效應分子。BAK、BAX 引起線粒體外膜構(gòu)象變化，是啟動凋亡的重要步驟，而Bcl-2 可以有效地抑制二者的活性［6］。Bcl-2 從被發(fā)現(xiàn)起，在腫瘤中它的過表達都預示著不良的預后。PLCε1 對鈣離子信號-凋亡通路的調(diào)節(jié)有重要作用，可能與Bcl-2 在凋亡的調(diào)控上存在交集，相互影響。

近年的多項研究認為PLCε1 與多種腫瘤有關(guān)，這讓PLCε1 逐漸成為國內(nèi)外學者關(guān)注并感興趣的一個研究領(lǐng)域。這些研究發(fā)現(xiàn)PLCε1 通過多途徑、多通路在惡性腫瘤的發(fā)生和進展過程中扮演重要角色。PLCε1 在食管癌組織中的高表達可能與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤進展有關(guān)聯(lián)［7］。ZHAI 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除PLCE1 基因，能降低胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子snail 的水平從而抑制細胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）發(fā)生。在對PLCε1 的不斷研究中，眾多的學者發(fā)現(xiàn)，PLCε1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌多種惡性腫瘤罹患風險有關(guān)，并且影響其發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及預后［9-11］。ras 基因?qū)τ谝认侔┣橛歇氱?，有研究證明超過80%的這種惡性腫瘤存在K-ras 突變［12］。PLCε1 與ras 基因的關(guān)系十分密切，與ras 家族成員有雙向作用。PLCε1 含有特異性的RA 區(qū)（Ras-associating domains），可與ras 家族的多種蛋白相結(jié)合。PLCε1 又被認為是ras 家族的直接下游效應分子之一［13］。因此，PLCε1或許也參與對胰腺癌的調(diào)控。

在PLCε1 被研究證實可能成為腫瘤預防治療潛在靶點的同時，眾多學者還發(fā)現(xiàn)PLCε1 可以通過上調(diào)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白細胞介素4（IL-4）等多種炎癥因子促進炎癥風暴。在缺血再灌注小鼠模型中檢測到PLCε1 表達增加，通過NF-κB 影響下游IL-6、TNF-α、IL-1 等多種炎癥因子的表達，加重再灌注時的心肌損害［14］。研究提示血管生成是癌變和腫瘤增殖等病理生理過程中不可或缺的部分，絕大多數(shù)新生血管病理過程與炎癥有關(guān)［15］。

由此看來，PLCε1 對ras、腫瘤有重要調(diào)節(jié)作用，與Bcl-2 在凋亡機制調(diào)節(jié)中可能有共同的通路或調(diào)節(jié)機制。可是在胰腺癌的研究中鮮有關(guān)于PLCε1 的報道，PLCε1 在胰腺癌中具體作用、相關(guān)機制都不明確，所以筆者嘗試從PLCε1 的表達入手，探索它和胰腺癌潛在的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

可調(diào)溫烤箱DHP060 型（上海）；光學顯微鏡102 型（Olympus 公司）；冰箱（西門子公司）；可調(diào)微量移液器（Eppendorf 公司）。組化試劑盒（KIT-5020，羊抗鼠/兔，福州邁新公司）；一抗：兔抗人PLCε1 多克隆抗體（美國Abcam 公司，產(chǎn)品編號：ab121476），兔抗人Bcl-2 多克隆抗體（美國Abcam 公司，產(chǎn)品編號：ab7973）；DAB 試劑盒、EDTA 抗原修復液（博士德生物工程有限公司），本研究經(jīng)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實驗資料 收集中南大學湘雅醫(yī)院確診為胰腺癌患者（2013 年1 月至2016 年12 月）的腫瘤組織標本69 例作為腫瘤組。另外收集特殊肝、腎移植手術(shù)供體的正常胰腺組織標本11 例作為研究對照組。

1.2.2 免疫組化檢測 按說明書步驟進行操作。PLCε1 一抗的稀釋濃度為1∶400，Bcl-2 一抗的稀釋濃度為1∶400。二抗稀釋濃度為1∶10。

收集整理患者信息、臨床病例資料。針對性選取所需組織蠟塊（胰腺癌腫瘤/正常胰腺組織），切片脫蠟切片水化、抗原修復、H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；PLCε1 和Bcl-2 免疫組化染色，血清封閉、滴加一抗過夜孵育、二抗孵育等步驟。

1.3 結(jié)果判讀

雙盲法閱讀玻片。PLCε1、Bcl-2 陽性著色在胰腺癌細胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色（PLCε1 和Bcl-2 分別圖1、圖3）。參考KOHLBERGER 的［16］免疫反應評分（immunoreactivity score, IRS）法評分：記錄染色強度及陽性細胞數(shù)得分，兩者相乘后獲得最終得分，根據(jù)得分情況分為陰性“-”、弱陽性“+”、中強陽性“++”、強陽性“+++”。0 分表示（-），1 分表示（+），2～4 分表示（++），＞4 分表示（+++）。陽性細胞數(shù)＜5%：0 分；陽性細胞數(shù)5%～30%：1 分；陽性細胞數(shù)31%～60%：2 分；陽性細胞數(shù)＞60%：3 分。陽性細胞著色強度：淡黃色1 分，黃色2 分，棕黃色3 分。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。腫瘤組與對照組中PLCε1 和Bcl-2 各自的表達差異以及不同臨床特征分組內(nèi)的分析采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法；二者各自表達強度在臨床及病理學特征組之間的分析使用非參數(shù)兩獨立樣本檢驗；二者染色強度之間的關(guān)系使用雙因素相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 PLCε1 與Bcl-2 在腫瘤組和對照組中的表達

PLCε1 和Bcl-2 主要表達于細胞胞漿內(nèi)。69例患者的腫瘤組織中有58 例PLCε1 表達陽性（見圖1），占84.1%，11 例為陰性（見圖2），占15.9%；Bcl-2 在59 例腫瘤組織中為陽性表達，占85.5% （見圖3），10 例為陰性（見圖4），占14.5%。在11 例對照組中，4 例PLCε1 表達為陽性，7 例為陰性；Bcl-2 有 3 例是陽性表達，其他8 例呈陰性。通過統(tǒng)計學軟件分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組與對照組之間的 PLCε1 表達和 Bcl-2 表達差異有統(tǒng)計學意義 （P1＜0.05,P2＜0.05）（見表1）。提示在胰腺癌組織中 PLCε1 和 Bcl-2 的表達強于正常胰腺組織。

2.2 腫瘤組中 PLCε1 與 Bcl-2 與臨床病理特征的關(guān)系

在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組內(nèi)，PLCε1 和 Bcl-2 各自表達明顯不同（P=0.016 和P=0.029）。對于其他分組而言差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示 PLCε1和 Bcl-2 可能與細胞遷移、轉(zhuǎn)移有關(guān)（見表2）。

2.3 腫瘤組中 PLCε1 和 Bcl-2 的染色強弱與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計學分析 （Mann-Whitney 檢驗） 發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小組間和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間的 PLCε1 和 Bcl-2的表達強弱程度有差異，其余分組的差異無統(tǒng)計學意義 （見表3）。結(jié)果提示，對于腫瘤＞5 cm 并存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，其 PLCε1 和 Bcl-2會有更多的陽性、強陽性表達。

表1 腫瘤組與對照組PLCε1 和Bcl-2 表達

表2 腫瘤組PLCε1 和Bcl-2 的表達情況 例

2.4 腫瘤組PLCε1 和Bcl-2 染色程度的關(guān)系

將PLCε1 和Bcl-2 在腫瘤組織中的染色得分賦值，陰性為0；弱陽性為1；陽性為2；強陽性為3。腫瘤組中PLCε1 與Bcl-2 的染色強度相關(guān)性分析顯示，二者強度呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.639,P=0.000）。

圖1 胰腺癌組織中的PLCε1 的陽性染色圖

圖2 正常胰腺組織PLCε1 陰性染色圖（×400）

圖3 胰腺癌組織中Bcl-2 的陽性染色圖

3 討論

圖4 正常胰腺組織Bcl-2 陰性染色圖（×400）

PLCε1 是重要的信號調(diào)節(jié)分子，涉及到多種細胞機制。有研究發(fā)現(xiàn)PKC 對胰腺癌有促進作用［17］。PLCε1 能通過NF-κB 和VEGF-C/Bcl-2 兩條信號通路，促進食管癌新生血管生成和細胞增殖［18］。還有microRNA 研究顯示，MiR-34a 能特異性降低PLCε1 mRNA 水平，進而抑制癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移［19］。Snail、PKCα/NF-κB 通路也可以受PLCε1 調(diào)控，增加腫瘤細胞分裂，促進轉(zhuǎn)移發(fā)生［8，20］。這些研究顯示PLCε1 能夠通過下游信使發(fā)揮促瘤作用。不僅如此，PLCε1 還對ras 家族具有雙向調(diào)節(jié)作用，可以被其激活，也可以作為其下游效應分子。眾所周知，ras 家族成員對腫瘤有重要促進作用。隨著對ras 基因家族研究的逐步深入，研究者發(fā)現(xiàn)近30%的腫瘤內(nèi)存在ras 基因的突變，且在胰腺癌中更為突出（超過80%），并涉及到其發(fā)展的各個時期進行研究［21-22］。Bcl-2 家族非常龐大，根據(jù)對凋亡調(diào)控的正負不同作用可將其分為兩個集團。BAK、BAX 與單BH3 結(jié)構(gòu)域的分子合集對凋亡進行正向調(diào)控，這其中包含了BAD、BIK、BMF 等。而Bcl-2 及其衍生分子在細胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)對凋亡有負向調(diào)控作用。多種分子蛋白相互之間有激活或抑制的作用，使的復雜的凋亡調(diào)控網(wǎng)絡中正、負效應之間達到平衡。而某種或多種作用導致平衡被打破，Bcl-2 過表達，細胞凋亡抑制，是腫瘤發(fā)生的始動因素以及促進因素中十分重要的部分［3，6，23］。

從筆者的實驗結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，PLCε1 在腫瘤組中的表達顯著強于對照組，筆者推測它可能有促進胰腺癌的作用。這與其他學者研究中PLCε1扮演著促進腫瘤進展的角色相符合。根據(jù)腫瘤組的結(jié)果，僅針對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，PLCε1 和Bcl-2 的染色情況存在差異，這意味著PLCε1 可能直接或間接參與某些促進胰腺癌轉(zhuǎn)移的機制。對于腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，PLCε1 和Bcl-2 的表達程度均存在顯著差異。這意味著如果腫瘤超過5 cm或者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，腫瘤組織中會有更多的PLCε1 和Bcl-2。這可能是因為PLCε1 和Bcl-2 與胰腺癌的轉(zhuǎn)移和生長相關(guān)。LAD 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，H-ras 可通過PLCE 抑制整合素產(chǎn)生，增加細胞的不穩(wěn)定性，使其易于移動、擴散。OU 等［10］研究中發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中降低PLCε1 表達后，膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力會受到抑制。

除了DAG，PLCε1 產(chǎn)生的另一個信使—IP3，可調(diào)節(jié)鈣離子信號通路［25］。IP3可以對IP3R 進行激活，并活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道，從而達到提高細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的效果。此時線粒體得到響應，外膜上的鈣離子通道被激活，攝入胞質(zhì)內(nèi)過載的鈣離子，從而增加細胞質(zhì)與線粒體內(nèi)兩個部位的鈣離子濃度［26］，并活化多種與鈣離子相關(guān)的酶，如Calpain、NOS 等。這些酶活化后可以通過多種途徑促進凋亡［27］。研究表明細胞凋亡需要IP3調(diào)節(jié)的鈣離子通路參與，而PLCε1 可以影響IP3調(diào)節(jié)，從而影響細胞凋亡。但是，這似乎與PLCε1 被發(fā)現(xiàn)的促瘤作用有些相矛盾。在胸腺瘤相關(guān)的報道中［28］表示，IP3對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3R 的激活作用可以被Bcl-2 阻斷。XU［29］等在乳腺癌的研究中證明，Bcl-2 通過與IP3R 競爭性的結(jié)合，抑制鈣離子釋放，進而抑制線粒體凋亡途徑。還有研究提示Bcl-2 能通過BH4 片段阻斷IP3R 受體［30］。對腫瘤組織中PLCε1 與Bcl-2 染色進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩個蛋白染色呈正相關(guān)。所以筆者推測，Bcl-2 在胰腺癌組織中高表達，然后通過多種機制，干擾PLCε1 對鈣離子通路的調(diào)節(jié)，兩者協(xié)同地促進腫瘤生長。

綜上，對于胰腺癌患者，其胰腺組織中PLCε1和Bcl-2 的表達高于正常胰腺組織，兩者可能與胰腺癌的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)。而PLCε1 和Bcl-2 在胰腺癌表達中密切相關(guān)，提示兩者可能共同參與胰腺癌內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)。