CD14啟動子-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族2型糖尿病患者下肢動脈硬化的相關性

金 明，鄭壽煥，金光明

（延邊大學附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000）

下肢動脈硬化（Lower limb arteriosclerosis，LLAS）是2型糖尿病（T2DM）最常見的大血管并發(fā)癥之一，根據(jù)學者研究，T2DM患者發(fā)生LLAS并發(fā)癥的概率最高可達到46%[1]，糖尿病病程5年、5～10年和10年以上者，LLAS發(fā)病率分別是22.6%、23%和66.7%[2]。當患者在臨床中出現(xiàn)諸如雙下肢靜息痛、間歇性跛行、缺血性壞疽等癥狀時，常常表示下肢動脈缺血已經(jīng)相當嚴重，此時在臨床上治療方法較為有限。尤其是動脈硬化 （AS）和硬化斑塊 （Arteriosclerosis plaques，ASP）形成會引起動脈管腔的狹窄、閉塞，引發(fā)下肢缺血缺氧，最終導致下肢壞疽、壞死，這些均為T2DM患者截肢致殘，甚至死亡的最重要原因，嚴重威脅患者的健康。因此，對LLAS進行早期診斷、早期干預極為重要。本課題組經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，CD14啟動子-159位點基因多態(tài)性與T2DM患者頸動脈硬化、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病變這些大血管及微血管病變存在相關性，但對于其與LLAS的關聯(lián)仍有待研究。延邊地區(qū)是我國最大的朝鮮族聚集地，而邊疆地區(qū)少數(shù)民族的健康問題一直是黨和國家關心的問題，因此在本實驗中，我們探討了CD14啟動子-159位點基因多態(tài)性在中國延邊地區(qū)朝鮮族T2DM患者中的分布情況，探討該位點的基因多態(tài)性與朝鮮族T2DM患者發(fā)生LLAS的關系，旨在從基因水平上對LLAS的發(fā)病進行早期預防、早期治療，達到造福邊疆地區(qū)少數(shù)民族患者的目的。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象

選取本院住院的朝鮮族T2DM患者268例，其中男153例、女115例，平均年齡（53.60±10.38）歲。以臨床上公認的1999年WHO的T2DM診斷標準作為依據(jù)。根據(jù)彩色多普勒超聲結果共篩選出AS患者229例，其中無斑塊（ASNP）患者172例，ASP患者57例。

1.1.2 儀器與檢查方法

選擇西門子公司S2000型多功能彩色多普勒超聲診斷儀，選用血管專用淺表探頭，頻率為7.5 MHz。受檢者檢查前l(fā) h禁煙酒，檢查前平臥10 min，打開外周血管動脈條件，取樣容積設為5 mm，探頭置于雙下肢表面，沿血管中央縱切探查，超聲波與血流夾角＜60°。仰臥位時掃查股總動脈、股淺動脈，掃查腘動脈時囑患者采用俯臥位，雙下肢伸直，略分開。檢查時注意兩側(cè)對比，下肢動脈縱切面圖像應通過二維超聲顯示。測量內(nèi)-中膜厚度（IMT），以IMT≥1 mm作為AS診斷標準，以IMT≥1.5 mm為ASP形成標準[6]（圖1）。

1.1.3 臨床資料采集

記錄受試者年齡、性別、血壓、病程、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、吸煙、飲酒與否和實驗室檢查數(shù)據(jù)，包括空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等。BMI=體質(zhì)量（kg）/身高（m）2。

1.2 方法

基因型檢測：提取DNA后進行PCR擴增，選用Promega公司產(chǎn)品，上游引物為：5，-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3，下游引物為：5，-GTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3。之后取PCR擴增產(chǎn)物10μL，用限制性內(nèi)切酶AvaⅡ酶切（Promega公司）CD14基因-159位點。反應結束后進行電泳，結果用紫外燈拍攝。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，CD14啟動子-159位點基因型分布符合遺傳平衡定律，符合等位基因頻率在人群中的分布。

2.1 CD14基因型分析

CD14 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后基因型有3種，CC型（497 bp），CT型（497，353，l44 bp），TT型（353，144 bp）（圖2）。測序結果表明該位點存在C-T的基因多態(tài)性（圖3）。

2.2 ASNP組和ASP組基因多態(tài)性分布的比較

將CD14啟動子-159位點的CC純合子基因頻率與CT雜合子及TT純合子基因比較，發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學差異（χ2=0.027，P＜0.05）（表1）。

表1 ASNP組和ASP組CD14啟動子-159位點CC和CT+TT基因型分布比較（例）

2.3 一般臨床資料比較

ASP組收縮壓（SBP）顯著高于ASNP組，（165.55±15.71）mmHg vs（154.78±15.18）mmHg（P＜0.05），但在舒張壓（DBP）、年齡、性別、病程、BMI、FBG和血脂方面無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.4 ASP危險因素的Logistic回歸分析

患者被認為是一個隊列，而ASP被用作一個獨立變量。年齡、性別、病程、吸煙、飲酒、BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG、C242T突變的存在是Logistic回歸的相關變量。表3結果顯示，病程和吸煙是ASP的獨立危險因素，而C等位基因突變是ASP的風險因素，存在C突變的T2DM患者合并ASP風險增高61%（表3）。

3 討論

圖1 AS和ASP彩色多普勒超聲對比圖。圖1a：內(nèi)膜厚度為1.2 mm（＜1.5mm），診斷為AS，圖1b：內(nèi)膜厚度為2.1 mm（＞1.5 mm），診斷為ASP。Figure 1.Comparison of AS and ASP in color Doppler ultrasonography.The thickness of the intima-media in the left image is 1.2 mm(＜1.5 mm),diagnosed as AS,the thickness of the intima-media in the right image is 2.1 mm (＞1.5 mm),diagnosed as ASP.

圖2 CD14啟動子-159位點基因型。M：DNA標記物；1，5：CT基因型；2：CC基因型；3，4，6：TT基因型。圖3 CD14啟動子-159位點基因型測序圖。圖3a：CC純合子，箭頭表示突變型；圖3b：TT純合子，箭頭表示突變型。Figure 2.CD14 promoter gene-159 genotype.M：DNA marker;1,5：CT genotype;2：CC genotype;3,4,6：TT genotype.Figure 3.The sequencing map of CD14 promoter gene-159 genotype.Figure 3a：CC homozygous genotype,the arrow indicates a mutant;Figure 3b：TT homozygous genotype,and the arrow indicates a mutant type.

表2 ASNP組和ASP組患者各組間臨床資料比較

表3 ASP危險因素的Logistic回歸分析

T2DM患者主要表現(xiàn)為糖代謝與脂代謝的雙重紊亂，其高血糖和高血脂狀態(tài)會刺激血小板在血管內(nèi)皮聚集，從而導致血液黏滯度增高，因血流動力學改變引起動脈內(nèi)皮細胞缺血缺氧，最終破壞內(nèi)皮的血管屏障功能[7]。在彩色多普勒超聲上，主要表現(xiàn)為二維圖像上的動脈IMT彌漫性增厚形成AS，嚴重者形成ASP，當斑塊堵塞30%以上管腔時，則會造成管腔狹窄、甚至閉塞。

CD14是革蘭陰性細菌細胞壁成分脂多糖（LPS）的受體，其與LPS特異性結合后，可通過Toll樣受體-4以及MD2蛋白向下游傳遞激活信號，從而啟動單核-巨噬細胞系統(tǒng)（MPS），并釋放多種炎性細胞因子發(fā)生一系列反應[8]，加速蛋白質(zhì)糖化產(chǎn)物的形成并導致其在血管內(nèi)堆積，引起血管平滑肌細胞的增生和動脈內(nèi)中膜增厚[9]；其次可引發(fā)膠原蛋白Ⅲ過量合成[10]或者直接作用于管壁細胞，血管細胞外基質(zhì)的大量堆積[11]，引起纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著動脈管壁，使內(nèi)中膜增厚、血栓形成，最終導致AS及ASP形成[12]。

種族和生活環(huán)境的差異被認為與疾病差異性密切相關，朝鮮族飲食習慣中鹽分含量高，男性喜飲酒、吸煙，這些均被認為是造成T2DM的高風險因素。其具體機制為煙草中的氧自由基等物質(zhì)，會損傷患者的血管內(nèi)皮，造成血管活性平衡失調(diào)，增加患者血管的僵硬度；另外，煙草中某些成分會導致患者的膽固醇代謝紊亂，引起血管壁膽固醇清除下降，膽固醇不斷堆積于動脈壁，加快AS的發(fā)展[13]。至于病程與ASP之間存在相關性則更好理解，隨著病程的延長，T2DM患者代謝紊亂日益加重，造成大血管病變是疾病發(fā)生發(fā)展的自然過程。

隨著基因研究的迅猛發(fā)展，越來越多的學者喜歡從遺傳、基因水平解釋疾病易感性的不同。在本研究中我們對延邊地區(qū)朝鮮族T2DM患者CD14啟動子-159位點進行了基因型的調(diào)查。從結果來看，AS和ASP患者相比較，CD14啟動子-159位點CC純合子基因頻率要明顯高于CT雜合子及TT純合子基因，兩者之間存在顯著差異（P＜0.05）。

根據(jù)本研究所示，CD14啟動子-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族T2DM患者并發(fā)ASP存在相關性，患者中CC純合子基因是較高的危險因素。因此，通過對高危人群進行基因檢測，可以早期發(fā)現(xiàn)并排除隱患，及早進行干預治療，意義重大。而彩色多普勒超聲以其價廉、無創(chuàng)、實時可重復等優(yōu)點，具有廣泛的應用前景。但有一點需要注意，操作者術水平是影響檢測結果的一個重要因素，因此應提高操作者技術水平，按照標準操作流程進行檢查。