不同施氮水平對(duì)烤煙葉片關(guān)鍵酶活性的影響

魏永濤 母明新 何佶弦

摘要 ? ?采取大田試驗(yàn)，以烤煙品種云煙87為試驗(yàn)材料，研究不同施氮水平對(duì)烤煙葉片硝酸還原酶活性、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量等生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，15～75 kg/hm2施氮水平范圍內(nèi)在烤煙整個(gè)生育期，硝酸還原酶活性先升高后下降，并在60 d左右達(dá)到最高水平;丙二醛含量隨著生育期的延長(zhǎng)不斷升高;超氧化物歧化酶活性隨生育期先升高后降低;過(guò)氧化物酶活性隨生育期不斷下降。在同一生育時(shí)期內(nèi)，硝酸還原酶活性、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性隨施氮水平的升高而升高，丙二醛含量隨施氮水平的提高而有所下降。因此，適當(dāng)增加氮肥使用量有利于烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育和氮同化，提高烤煙的抗衰老、抗逆性和抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 ? ?烤煙;施氮水平;葉片;酶活性

中圖分類號(hào) ? ?S572 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2019）20-0016-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract ? ?Taking Yunyan 87 as the test material，the field test was conducted to study the effects of different nitrogen application levels on the physiological indexes such as nitrate reductase activity，superoxide dismutase activity，peroxidase activity and malondialdehyde content in flue-cured tobacco leaves. The results showed that during the whole growth period of flue-cured tobacco，nitrate reductase activity first increased and then decreased，and reached the highest level at about 60 days.The content of malondialdehyde increased with the prolongation of growth period.The activity of superoxide dismutase first increased and then decreased with the growth period.Peroxidase activity decreased with the growth period.During the same growth period，nitrate reductase activity，superoxide dismutase activity and peroxidase activity increased with the increase of nitrogen application level，while malondialdehyde content decreased with the increase of nitrogen application level.The results showed that increasing the use of nitrogen fertilizer was beneficial to the growth and nitrogen assimilation of flue-cured tobacco，and improve the anti-aging，stress resistance and antioxidant capacity of flue-cured tobacco.

Key words ? ?flue-cured tobacco;nitrogen application level;blade;enzymatic activity

氮素是自然界中所有生命個(gè)體的最基本元素，也是影響烤煙質(zhì)量和產(chǎn)量的最重要因素之一。煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)決定了其經(jīng)濟(jì)效益。要想獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的烤煙，必須嚴(yán)格控制氮素用量。因此，人們常通過(guò)控制氮肥施用量的方法來(lái)調(diào)控烤煙生長(zhǎng)的氮素水平，從而調(diào)控烤煙的生長(zhǎng)。氮肥使用過(guò)多，烤煙生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，采摘期不會(huì)自然退黃，形成“黑爆煙”，制作的成煙品質(zhì)也很差;氮肥使用量不夠，不利于煙草早產(chǎn)快發(fā)，煙株生長(zhǎng)延緩，各種化學(xué)成分含量不均衡，產(chǎn)量也會(huì)下降，烘烤后的煙葉葉片又薄又輕，質(zhì)量低劣，因而適宜的施氮水平是獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)煙葉的前提。本文通過(guò)研究烤煙葉片幾種關(guān)鍵酶活性，明確烤煙生長(zhǎng)的內(nèi)在生理變化。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為云煙87。

1.2 ? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用大田試驗(yàn)，共設(shè)置6個(gè)氮素水平處理，分別為CK，空白，不施氮肥;N1，低氮，15 kg/hm2;N2，中低氮，30 kg/hm2;N3，中氮，45 kg/hm2;N4，中高氮，60 kg/hm2;N5，高氮，75 kg/hm2。3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積66.7 m2。

1.3 ? ?試驗(yàn)過(guò)程

烤煙于2017年5月9日移栽，行距1.20 m，株距0.55 m，其中CK、N1、N2、N4、N5的磷、鉀水平以N3為準(zhǔn)（N∶P2O5∶K2O=1∶2∶3），其他栽培管理措施保持一致。

1.4 ? ?測(cè)定指標(biāo)與方法

在烤煙移栽后共取樣5次，分別在烤煙移栽后30、45、60、75、90 d時(shí)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的煙株，取功能葉片作為檢測(cè)對(duì)象，測(cè)定硝酸還原酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性。不同指標(biāo)具體測(cè)定方法如下：硝酸還原酶活性采用活體法[1]測(cè)定、丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法[2]測(cè)定、超氧化物歧化酶活性采用NBT光化還原法[3]測(cè)定、過(guò)氧化物酶采用愈創(chuàng)木酚法[4]測(cè)定。

1.5 ? ?統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Microsoft Word 2013、Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，采用LSD法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?不同施氮水平對(duì)烤煙葉片硝酸還原酶活性的影響

硝酸還原酶（NR）是煙草氮代謝的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)酶和限速酶，煙草體內(nèi)硝酸還原酶活性的強(qiáng)弱能直接影響其對(duì)氮素的利用效率，從而影響煙草體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)的合成，因而可以用硝酸還原酶的活性來(lái)表示煙草氮代謝的強(qiáng)弱，將其作為煙草氮素營(yíng)養(yǎng)診斷指標(biāo)[5]。

由圖1可以看出，在整個(gè)生育期內(nèi)，整個(gè)大田的烤煙葉片硝酸還原酶活性總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，前期上升趨勢(shì)較緩慢，然后呈迅速下降趨勢(shì)。在烤煙各個(gè)不同的生育時(shí)期，其葉片中硝酸還原酶活性總體表現(xiàn)均為N5>N4>N3>N2>N1>CK，在每個(gè)生育期內(nèi)施氮量最高N5（75 kg/hm2）的情況下硝酸還原酶活性均為最高，在不施氮肥的的情況下（CK）除75 d時(shí)硝酸還原酶活性有所偏差外，其余各時(shí)期硝酸還原酶活性均為最低。由此可見(jiàn)，施氮水平對(duì)烤煙葉片硝酸還原酶活性是有影響的，并且在一定范圍內(nèi)隨施氮水平的提高硝酸還原酶活性逐漸升高。

從差異性分析來(lái)看，在30、45、60、75、90 d內(nèi)，各生育期內(nèi)隨施氮水平上升硝酸還原酶活性均表現(xiàn)出差異性。不僅如此，N5組在30、75 d時(shí)硝酸還原酶活性與其余各組差距均達(dá)到顯著水平，在45 d和60 d除與N4差異不顯著外，與其余各組也呈現(xiàn)顯著性差異，說(shuō)明施氮水平的高低對(duì)烤煙葉片中硝酸還原酶活性的影響具有顯著性。

2.2 ? ?不同施氮水平對(duì)烤煙葉片丙二醛含量的影響

由圖2可以看出，在相同生育期內(nèi)，丙二醛（MDA）含量為CK>N1>N2>N3>N4>N5，同時(shí)在30、45、60、75、90 d內(nèi)各施氮水平間均達(dá)到差異水平。而施氮量較高的N3、N4、N5組丙二醛含量與施氮量較少的N1、N2和不施氮肥的CK組丙二醛含量差異顯著。因此，為了烤煙更好地生長(zhǎng)，提高烤煙抗逆性和抗衰老性，在種植時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高施氮量。

2.3 ? ?不同施氮水平對(duì)烤煙葉片超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是生物抗氧化酶類的重要成員，其可催化超氧陰離子自由基的分解，是清除活性氧危害的第一道防線[6-7]?？緹熑~片中超氧化物歧化酶活性的高低能影響自身清除有害物質(zhì)的能力，標(biāo)志著葉片的衰老程度。由圖3可以看出，隨著烤煙生育期的進(jìn)行，大田烤煙葉片中超氧化物歧化酶活性先升高后降低，其活性在烤煙移栽后60 d達(dá)到最大值。在同一生育期內(nèi)，不同施氮水平的烤煙葉片超氧化物酶活性隨施氮量的升高而增加，總體表現(xiàn)為CK

2.4 ? ?不同施氮水平對(duì)烤煙葉片過(guò)氧化物酶活性的影響

過(guò)氧化物酶（POD）是生物抗氧化酶類的另一重要成員。由圖4可以看出，在大田烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，6個(gè)處理均表現(xiàn)出葉片中過(guò)氧化物酶活性隨生育期的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在成熟期活性很小。在相同生育期內(nèi)，由于施氮水平的不同，過(guò)氧化物酶活性有所不同，隨著施氮水平的上升，過(guò)氧化物酶活性增高，總體表現(xiàn)為CK

3 ? ?結(jié)論與討論

大量研究證明，烤煙的不同氮素供應(yīng)形態(tài)、不同施氮水平、不同的農(nóng)藝管理措施、植煙土壤等均會(huì)對(duì)烤煙葉片硝酸還原酶活性產(chǎn)生影響[8-10]。不僅如此，同一煙株的不同生育期、不同部位也會(huì)有所差別，這主要與基因的表達(dá)與硝酸還原酶的分布有關(guān)[11]。

在正常的生理代謝條件下，生物體內(nèi)會(huì)有活性氧（ROS）的產(chǎn)生?；钚匝醍a(chǎn)生的主要途徑是氧分子進(jìn)行單電子還原形成超氧陰離子的自由基，再通過(guò)其他途徑形成活性氧[12-13]。活性氧不僅對(duì)蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生破壞作用，還會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用導(dǎo)致膜的分解，破壞膜的結(jié)構(gòu)，同時(shí)產(chǎn)生丙二醛（MDA），丙二醛含量過(guò)高，則表明植物受損嚴(yán)重，抗氧化性和抗衰老性較差[14-16]。丙二醛作為植物生理的一個(gè)重要指標(biāo)，人們長(zhǎng)期以來(lái)從未放棄對(duì)它的研究，而將其運(yùn)用到對(duì)烤煙生理生化水平的檢測(cè)，能更好地明確烤煙的生長(zhǎng)狀況。

自由基衰老學(xué)說(shuō)認(rèn)為，植物老化的過(guò)程就是活性氧代謝失衡，導(dǎo)致活性氧的累積從而危害自身是植株走向衰老的過(guò)程[17-18]。過(guò)氧化物酶（POD）對(duì)過(guò)氧化氫有較高的親和力，能催化底物與過(guò)氧化氫的反應(yīng)，從而清除超氧化物歧化酶分解等代謝過(guò)程產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，清除使植株走向衰老的活性氧等物質(zhì)[19]。

研究結(jié)果顯示，在整個(gè)生育期內(nèi)，大田烤煙葉片硝酸還原酶活性總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在烤煙移栽后60 d左右達(dá)到最大值，而在相同生育期內(nèi)硝酸還原酶活性隨施氮水平的提高而增加，在最大氮素水平75 kg/hm2時(shí)達(dá)到最大，說(shuō)明在15～75 kg/hm2施氮范圍內(nèi)，75 kg/hm2左右最適合烤煙生長(zhǎng)發(fā)育和代謝及合成有機(jī)物。丙二醛含量在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不斷積累升高，并受施氮水平的抑制，在75 kg/hm2施氮水平下丙二醛含量最低。

對(duì)超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶而言，超氧化物歧化酶活性隨生育期進(jìn)行先升高后下降，并隨施氮水平的提高而有所上升;過(guò)氧化物酶活性隨生育期進(jìn)行不斷降低，也隨施氮水平的增加而升高，兩者在烤煙生長(zhǎng)發(fā)育后期活性都迅速下降。

對(duì)比硝酸還原酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性可以發(fā)現(xiàn)，在75 kg/hm2的施氮水平下，烤煙發(fā)育的旺長(zhǎng)期，丙二醛含量適宜，硝酸還原酶活性、超氧化物歧化酶活性和過(guò)氧化物酶活性都具有較高的水平;而在煙葉成熟期，丙二醛含量低，硝酸還原酶活性、超氧化物歧化酶活性和過(guò)氧化物酶活性都迅速下降，處于較低的水平。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)15～75 kg/hm2施氮水平下大田烤煙葉片硝酸還原酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性等相關(guān)參數(shù)的研究，得出以下結(jié)論：

一是在15～75 kg/hm2施氮水平范圍內(nèi)烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，硝酸還原酶活性先升高后下降，丙二醛含量逐漸升高，超氧化物歧化酶活性先升高后降低，過(guò)氧化物酶活性逐漸下降。二是在15～75 kg/hm2的施氮水平下烤煙相同生育期內(nèi)，硝酸還原酶活性、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性隨施氮水平的提高逐漸升高，丙二醛含量隨施氮水平的提高逐漸下降[20]。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 孫群，胡景江.植物生理學(xué)研究技術(shù)[M].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2006：170-171.

[2] 張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，1990：154-155.

[3] 白寶璋，李攸福.煙草測(cè)試與分析[M].合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1995.

[4] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2003：134-137.

[5] 陳永紅，王少先，王雪云.烤煙生物復(fù)合肥應(yīng)用研究發(fā)展[J].土壤肥料科學(xué)，2004，20（4）：152.

[6] 秦宏偉.植物衰老機(jī)理研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2007（7）：10-12.

[7] 田國(guó)忠，李懷方，裘維蕃.植物過(guò)氧化物酶研究進(jìn)展[J].武漢植物學(xué)研究，2001（4）：332-344.

[8] 趙洪祥，尚東輝，邊少鋒，等. 氮肥不同比例分期施用對(duì)玉米硝酸還原酶活性的影響[J].玉米科學(xué)，2009（6）：97-100.

[9] 余讓才，范燕萍，李明啟.光/暗轉(zhuǎn)換對(duì)小麥幼苗硝酸還原酶活性的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001（3）：37-39.

[10] 盧鳳剛，陳貴林.氮素濃度及形態(tài)對(duì)韭菜硝酸鹽及硝酸還原酶活性的影響[J].北方園藝，2011（4）：41-43.

[11] 杜瑛，李平.小麥不同生育期硝酸還原酶活性的測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（27）：16517-16518.

[12] 白英俊，李國(guó)瑞，黃鳳蘭，等.活性氧與植物抗氧化系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（36）：1-3.

[13] 張怡，路鐵剛.植物中的活性氧研究概述[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2011（4）：242-248.

[14] 黨云萍，李春霞，劉東雄.水分脅迫對(duì)植物生理生化研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（5）：89-93.

[15] 張平，謝潮添，楊盛昌.紅樹(shù)葉片衰老過(guò)程中活性氧和保護(hù)酶活性的變化[J].海洋科學(xué)，2004（5）：37-40.

[16] WU P，CHEN K S.Advances in plant molecular physiology[M].Hangzhou：Zhejiang University Press，2000：20.

[17] 李素云，王立芹，鄭稼琳，等.自由基與衰老的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2007（20）：2046-2048.

[18] 秦宏偉.植物衰老機(jī)理研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2007（7）：10-12.

[19] 宋月，崔婷婷，武麗娟，等.玉米葉片硝酸還原酶活性測(cè)定方法的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（15）：2817-2820.

[20] 王偉玲，王展，王晶英.植物過(guò)氧化物酶活性測(cè)定方法優(yōu)化[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2010，29（4）：21-23.