初步探究hsa_circ_0008797對胃癌細胞順鉑耐藥性的影響

劉文博，高 敏，劉婉婷，顧康生

胃癌在我國發病率、死亡率都很高[1]。胃癌早期無特異性癥狀，大部分患者一經確診已經處于胃癌的中晚期，失去根治性手術的機會。而不能手術的晚期胃癌患者目前主要的治療方式是以鉑類藥物為基礎聯合氟尿嘧啶藥物為主的化療。但是胃癌鉑類耐藥性的產生成為提高患者治療質量的一大難題。大量的研究[2]表明，環狀RNA(circRNA)能夠調節多種細胞生理和病理過程，circRNA在體內異常表達常與多種疾病相關，此外還與胰腺癌、乳腺癌等腫瘤的耐藥性有關。circRNA在胃癌中的作用也逐漸被學者們發現，circRNA可以作為胃癌早期診斷、預后分析的標志物[3]，但是circRNA與胃癌細胞耐藥性間的關系及機制依舊未知。為此本課題組通過CCK-8法及流式細胞術探討了circRNA hsa_circ_0008797與胃癌細胞耐藥性之間關系，為進一步探究circRNA作用胃癌細胞耐藥性產生的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料人胃癌細胞株AGS、BGC-823、SGC7901及其順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP均購于中國科學院上海細胞庫；shRNA質粒和過表達質粒購于上海吉馬制藥公司；胎牛血清購于浙江天杭生物(四季青)公司；細胞培養基RPMI-1640購于美國Hyclone公司；細胞RNA提取試劑TRIzol、轉染用脂質體2000(lipo2000)、Opti-mem培養基購于美國Invitrogen公司；逆轉錄酶試劑盒、SYRB熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；細胞毒性活力檢測CCK-8試劑盒購于上海碧云天公司；AnnexinV-FITC雙染細胞凋亡試劑盒購于貝博生物科技公司；實時熒光半定量PCR(RT-PCR)產物的測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 細胞培養四種胃癌細胞培養用10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素(雙抗)添加到細胞培養基RPMI-1640制成的完全細胞培養基，細胞常規培養在5%CO237 ℃的培養箱中。每天觀察細胞生長狀態，常規2～3 d更換培養基1次。待細胞匯合度達90%左右時進行細胞傳代。SGC7901/DDP細胞還需培養在含800 ng/ml順鉑的培養基中，以維持細胞順鉑耐藥性。

1.3 細胞的轉染挑選處于對數生長期的細胞，將其均勻接種到6孔板中，用不含雙抗的完全細胞培養基培養，待細胞生長匯合度至60%～70%時準備轉染。將含有shRNA質粒(4 μg)或者過表達質粒(3 μg)的載體分別加入到含有250 μl Opti-mem培養基的EP管中，輕混勻。另取1個無菌EP管加入250 μl Opti-mem培養基，再加入8 μl lipo2000,輕混勻，室溫孵育5 min。將上述兩管溶液混合均勻，室溫靜置20 min。更換6孔板中細胞培養基，每孔加入1.5 ml無雙抗的完全培養基。逐滴將混合溶液加入到6孔板中，邊加邊輕晃搖勻培養基。常規培養24 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞的轉染情況，如細胞轉染效率較高則更換新鮮培養基進行下一步實驗。shRNA序列：上游5′-CCACUCAAGAUGUAUGGUCTT-3′，下游5′-GACCAUACAUCUUGAGUGGTT-3′。

1.4 細胞RNA的提取挑選生長良好、對數生長期的細胞，將培養基吸盡，用冷PBS清洗2次，棄去廢液。加入適量的TRIzol試劑(6孔板中加200 μl,10 cm大皿加1 ml)吹打液體至澄清，靜置5 min。每1 ml裂解液中加入200 μl氯仿，立即手搖劇烈震蕩15 s，靜置5 min。4 ℃、11 240 r/min離心15 min，收集上清液至無酶EP管中。加入等量異丙醇，輕晃搖勻，靜置，上述條件離心10 min。棄上清液，加入1 ml 75%乙醇溶液，震蕩，使沉淀懸浮，4 ℃、8 880 r/min離心5 min，重復上述操作1次。空氣中干燥5～10 min，加入DEPC水，60 ℃放置10 min。采用紫外分光光度計Nanodrop1000檢測RNA濃度及純度，并稀釋定量。整個操作應該在無酶環境下進行，實驗所用耗材及試劑均為無酶。

1.5 RT-PCR根據逆轉錄試劑盒說明書，采用隨機引物法分別將從細胞中提取的RNA逆轉錄成cDNA。按照RT-PCR說明書依次將Premix Ex Taq 10 μl、上游引物0.8 μl、下游引物0.8 μl、ROX Refernece Dye 0.4 μl、cDNA 2 μl、無酶水6 μl加入到無酶的八聯管中，配成20 μl的擴增體系。上機檢測，擴增條件為：預變性95 ℃、30 s, 1個循環；定量分析95 ℃、5 s，60 ℃、31 s, 40個循環；溶解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s, 1個循環。以GAPDH為內參，GAPDH上游引物序列：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3′，下游引物序列：5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。hsa_circ_0008797的上游引物序列：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3′，下游引物序列：5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。每次實驗每個樣本設置兩個復孔，實驗重復3次。

1.6 CCK-8實驗將處于對數生長期生長狀態良好的SGC7901和SGC7901/DDP細胞分別接種于96孔板內，每孔接種細胞數約5×104個。培養過夜，按上述步驟進行轉染細胞，shRNA轉染SGC7901細胞，過表達質粒轉染SGC7901/DDP細胞。待細胞轉染48 h后，吸盡孔內培養基，分別在各孔中加入100 μl且含有下列順鉑濃度的培養基。SGC7901細胞各組順鉑濃度：0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml；SGC7901/DDP細胞各組順鉑濃度：0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml；常規培養48 h后，吸盡各孔中培養基，再用PBS洗滌細胞1次。依次在各孔加入100 μl新鮮培養基后，再加入10 μl CCK-8試劑，混勻，培養箱中培養1 h。最后將96孔板放置在酶標儀上，于490 nm處檢測各孔細胞的OD值。每個實驗重復3次以上，每次設置4個復孔。

1.7 細胞凋亡實驗分別將處于對數生長期的SGC7901和SGC7901/DDP細胞接種到6孔板中，培養至細胞匯合度為60%～70%，分別對細胞進行轉染。將轉染后的細胞置于CO2培養箱中培養48 h。分別將SGC7901細胞或SGC7901/DDP細胞培養在含順鉑濃度為0.2 μg/ml或2 μg/ml的不含雙抗的完全培養基中。培養24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶將細胞消化下來，冷PBS洗滌細胞2次，400 μl AnnexinV結合液重懸細胞。加入5 μl AnnexinV-FITC染色液，混勻，4 ℃避光15 min。加入10 μl PI染色液，混勻，4 ℃避光孵育5 min，上機檢測。

2 結果

2.1 hsa_circ_0008797在胃癌細胞株中的表達量通過RT-PCR檢測分析順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP與SGC7901的表達量，結果顯示：與親本細胞株SGC7901比較，SGC7901/DDP中hsa_circ_0008797表達量明顯較低，差異有統計學意義(t=11.93,P<0.01)；隨后檢測其他順鉑敏感胃癌細胞株AGS、BGC-823中hsa_circ_0008797的表達量，結果顯示：與順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP比較，hsa_circ_0008797在AGS、BGC-823細胞中的表達量較高，差異有統計學意義(t=50.51，P<0.001；t=9.596，P<0.05)。見圖1。

2.2 hsa_circ_0008797的鑒定通過circbase數據庫(http://www.circbase.org/)獲得hsa_circ_0008797的堿基序列并確定該circRNA拼接位點(Splice Junction)兩端的堿基序列。序列檢測發現hsa_circ_0008797來源于GSK3B外顯子7-10反向剪切拼接形成的環狀RNA。隨后通過對RT-PCR的產物進行Sanger測序，確定Splice Junction的存在，證明該circRNA確實以環狀結構存在，而非線性結構。見圖2。

圖1 hsa_circ_0008797在胃癌細胞株中的相對表達量

1：SGC7901/DDP；2：SGC7901；3：BGC823；4：AGS；與SGC7901/DDP細胞組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 hsa_circ_0008797的結構示意圖及鑒定

2.3 SGC7901/DDP細胞中hsa_circ_0008797過表達對細胞順鉑耐藥性的影響將構建的circRNA過表達質粒載體轉染到SGC7901/DDP細胞中。通過RT-PCR檢測分析circRNA質粒轉染細胞組(SGC7901/DDP-OE)、轉染無義組(SGC7901/DDP-NC)以及對照組(未被轉染的SGC7901/DDP細胞)中的hsa_circ_0008797的表達水平，驗證轉染是否成功且質粒能否在SGC7901/DDP細胞過表達該circRNA。結果顯示，與SGC7901/DDP組和SGC7901/DDP-NC組比較，SGC7901/DDP-OE組細胞hsa_circ_0008797的表達水平顯著增加，差異有統計學意義(F=711.6,P<0.000 1) (圖3A)。隨后分別以不同濃度的順鉑作用上述三組細胞，通過CCK-8法檢測細胞的毒性活力變化。實驗結果顯示：當順鉑濃度為2.5、5.0、10 μg/ml，胃癌細胞對順鉑的耐藥性降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01) (圖3B)。通過流式細胞術檢測hsa_circ_0008797的表達水平對SGC7901/DDP細胞凋亡產生的影響。結果顯示：SGC7901/DDP-OE組(15.23±1.6)%與SGC7901/DDP組(5.32±0.86)%和SGC7901/DDP-NC組(5.64±1.0)%比較，細胞的凋亡率明顯增加，差異有統計學意義(F=67.67,P<0.0001) (圖3C)。根據上述結果可見，上調hsa_circ_0008797的表達量可逆轉胃癌細胞對順鉑藥物的耐藥性。

圖3 過表達hsa_circ_0008797逆轉SGC7901/DDP細胞的順鉑耐藥性

A：RT-PCR分析轉染后hsa_circ_0008797的表達水平；B：CCK-8法測定轉染后的SGC7901/DDP細胞毒性活力；C：過表達質粒轉染SGC7901/DDP細胞的凋亡率測定；1：SGC7901/DDP組；2：SGC7901/DDP-NC組；3：SGC7901/DDP-OE組；與SGC7901/DDP組比較：****P<0.000 1；與SGC7901/DDP組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.4 敲低SGC7901細胞中的hsa_circ_0008797對細胞順鉑敏感性的影響基于上述實驗結果，通過shRNA將SGC7901細胞中hsa_circ_0008797的表達量敲低，RT-PCR分析shRNA轉染后的SGC7901細胞(SGC7901-KD)、轉染無義組(SGC7901-NC)及對照組(未轉染的SGC7901細胞)中hsa_circ_0008797的表達水平。結果顯示：SGC7901-KD組hsa_circ_0008797的表達量明顯低于SGC7901組和SGC7901-NC組，差異有統計學意義(F=24.95,P<0.001) (圖4A)。同樣，CCK-8實驗檢測不同濃度順鉑作用SGC7901細胞后細胞的毒性活力的變化。結果顯示：當順鉑濃度為0.25、0.5、1.0 μg/ml時，敲低hsa_circ_0008797的表達可增加細胞對順鉑的耐藥性，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01) (圖4B)。流式細胞術測定細胞凋亡率發現，敲低該circRNA在細胞中的表達后(5.33±0.57)%，與SGC7901組(12.09±1.47)%和SGC7901-NC組(11.49±1.10)%比較，細胞的凋亡率下降，差異有統計學意義(F=34.25,P<0.001) (圖4C)。綜上可見，敲低胃癌細胞中hsa_circ_0008797的表達可一定程度上增加胃癌細胞對順鉑的耐藥性。

3 討論

circRNA是一類廣泛存在細胞內且生物功能多樣的內源性RNA，它們主要是通過反向剪接拼接形成環狀的非編碼RNA，沒有5′端和3′端的多腺苷酸化尾巴[4]。過去的觀點認為，circRNA是基因剪切時錯配形成的產物或者由mRNA轉錄形成的副產物[5]。隨著生物信息技術和全基因測序技術的發展，越來越多circRNA逐漸被學者們發現，它在細胞中的功能也逐漸被研究和了解。circRNA具有豐富的生物學功能，它不僅可以調節細胞周期還可以促進細胞的自我增殖[6]。此外還有學者發現circRNA可以作為miRNA的海綿，靶向mRNA從而促進細胞自噬，由此可見circRNA還可能參與調控細胞的凋亡[7]。circRNA還具有翻譯蛋白的功能，Zhang et al[8]報道circRNA circ-PINT可以翻譯一種新的功能性多肽PINT87aa，以抑制各種致癌基因的轉錄時的延伸。circRNAs的異常表達在調節腫瘤細胞生長發育過程中起到重要作用，但它是一把雙刃劍，既可以發揮癌基因的作用，又可以擔當抑癌基因的角色，與腫瘤的侵襲性、遠處轉移以及腫瘤患者的預后有很大的關聯性[9]。與胃癌相關的circRNA也有報道，Li et al[10]研究證實hsa_circ_002059在胃癌組織中下調，其在手術后患者血漿中表達與手術前相比明顯降低。hsa_circ_002059的低表達與性別、年齡、遠處轉移和TNM分期顯著相關，可作為胃癌診斷的新型標志物。Chen et al[11]通過RNA測序分析發現circRNA circ-PVT1在癌組織中表達上調，circ-PVT1的高表達提示胃癌患者的無病生存期與總生存期更長。雙熒光素酶報告證實，circ-PVT1可作為miR-125家族的海綿間接調節E2F2轉錄因子的表達，促進細胞集落形成并參與細胞周期調控。

圖4 敲低hsa_circ_0008797減低SGC7901細胞對順鉑的敏感性

A：RT-PCR分析轉染后hsa_circ_0008797的表達水平；B：CCK-8法測定轉染后的SGC7901細胞毒性活力；C：過表達質粒轉染SGC7901細胞的凋亡率測定；1：SGC7901組；2：SGC7901-NC組；3：SGC7901-OE組；與SGC7901組比較：**P<0.01；與SGC7901組比較：#P<0.05,##P<0.01

盡管已經有學者通過實驗研究發現，某些circRNA與骨肉瘤[12]、胰腺癌[13]、乳腺癌[14]的化療耐藥性有關，但是關于circRNA在胃癌耐藥中作用的研究還未見報道，circRNA與胃癌耐藥性之間的關系目前還不清楚。本研究結果顯示hsa_circ_0008797在順鉑敏感細胞株AGS、BGS-823、SGC7901的表達量均高于順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP，表明hsa_circ_0008797可能增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。通過升高SGC7901/DDP細胞中hsa_circ_0008797的表達后發現細胞對順鉑的耐藥性降低。進一步的實驗結果表明，敲低SGC7901細胞中hsa_circ_0008797的表達，細胞對順鉑的耐藥性增高。可見hsa_circ_0008797的表達量與胃癌細胞的順鉑耐藥性成負相關。hsa_circ_0008797有望成為預測胃癌細胞順鉑療效的標志物，以及治療胃癌順鉑耐藥的潛在標志物。由于circRNA的調控細胞的機制十分復雜，后期將探究hsa_circ_0008797通過何種信號通路及途徑對胃癌細胞的耐藥性產生影響，從而進一步闡明胃癌順鉑耐藥產生的生物機制。