頂空氣相色譜法測定大豆異黃酮提取物中有機溶劑殘留

白旭東 周兆梅 黃媛 谷巖

【摘要】 目的：建立頂空氣相色譜法測定大豆異黃酮提取物中有機溶劑殘留的檢測方法。方法：采用頂空毛細管氣相色譜法，DB-624毛細管氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氫火焰離子化檢測器，載氣為氮氣，流速為2 mL/min;頂空進樣，頂空平衡溫度為80 ℃，平衡時間為30 min，進樣體積為1 mL。結果：測定的11種有機溶劑完全分離，線性關系良好，平均回收率在92.5%～101.2%;RSD均小于5%。結論：該方法快速、準確、靈敏，適合測定大豆異黃酮提取物中的有機溶劑殘留量。

【關鍵詞】 大豆異黃酮提取物;頂空氣相色譜法;有機溶劑殘留

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2020.05.020

Determination of Residual Organic Solvents in Soybean Isoflavone Extract by Headspace Gas Chromatography

BAI Xu-dong，ZHOU Zhao-mei，HUANG Yuan，GU Yan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract： Objective Establish a headspace gas chromatography method for detecting the residual organic solvents in Soybean Isoflavone extract. Methods Headspace capillary gas chromatography，DB-624 capillary gas chromatography column （30 m×0.32 mm，0.25 μm），hydrogen flame ionization detector，carrier gas is nitrogen，flow rate is 2 mL/min;headspace sampling，headspace the equilibrium temperature is 80 ℃，the equilibrium time is 30 min，and the injection volume is 1 mL. Results The measured 11 kinds of organic solvents are completely separated，with a good linear relationship，the average recovery rate is 92.5%～101.2%;RSD is less than 5%. Conclusion The method is fast，accurate and sensitive，and is suitable for determining the residual amount of organic solvents in soybean isoflavone extract.

Key words： soybean isoflavone extract;headspace gas chromatography;residual organic solvent

大豆異黃酮是黃酮類化合物的一種，是大豆生產過程中的次生代謝產物，包括大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、大豆黃素、黃豆黃素甙元、染料木素等12種成分[1]。研究表明， 大豆異黃酮具有對血管的防護作用、類似女性雌激素作用以及抗激素作用、抑菌活性和預防骨質疏松癥等多種生理功能， 最近還有研究證實它可能作為一種天然抗氧化劑， 而許多天然的抗氧化劑都具有抗腫瘤功效[2]。大豆異黃酮提取物的制備方法有機溶劑萃取法、加熱回流法、超聲波提取法、微波提取法和超臨界CO2萃取法等[3-6]。

隨著人們對保健食品的關注和青睞，以大豆異黃酮提取物為主要成分的保健食品越來越多，為了有效控制產品的質量和保證用藥安全，按照2020版《中國藥典》四部的要求和任用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）中藥品有機溶劑殘留量測定的指導原則，對大豆異黃酮提取物中殘留的有機溶劑進行檢測。本文采用頂空毛細管氣相色譜法測定甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、丙酮、苯及2-丁酮11種有機溶劑殘留。該方法操作簡單，結果準確、可靠，為制定大豆異黃酮提取物的質量標準提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC-2010氣相色譜儀（日本島津公司，配有FID檢測器和頂空進樣器）;SPB-3全自動空氣源（北京中惠普分析技術研究所）;SGH-300高純氫氣發生器（北京東方精華苑科技有限公司）。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、丙酮、苯及2-丁酮均為色譜純;DMSO為分析純。

11批大豆異黃酮提取物分別為不同的廠家來源（浙江、陜西、廣州、河南等地）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

混合標準溶液的制備：取甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、丙酮、苯及2-丁酮精密稱定，用DMSO制備成質量濃度為0.3，0.25，0.05，0.5，0.25，0.125，0.1，0.01，0.05，0.035 mg和0.05 mg的混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液5.0m L，置于20m L頂空瓶中， 加蓋密封。

1.2.2 樣品前處理

取本品1 g，精確稱定，置10 mL量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 ml置于10 mL頂空瓶中，加蓋密封。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：安捷倫DB-624毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm）;程序升溫：起始溫度為40 ℃，保持10 min，以8 ℃/min升溫至130 ℃，保持10 min;載氣為高純氮氣，流速為2 mL/min;檢測器為FID，檢測器溫度為250 ℃。

頂空進樣器條件：頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時間為30 min。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇與頂空條件的選擇

試驗中考察了DB-624、DB-5、DB-WAX三款毛細管色譜柱，并對程序升溫條件進行優化，通過試驗對比發現色譜柱DM-624分離效果最好，峰型對稱良好，所有溶劑均能有效檢出，最終選用色譜柱住DM-624。

考考察不同頂空平衡溫度（60，70，80，90 ℃）及不同平衡時間（20，30，40 min）對各待測溶劑色譜峰面積的影響，試驗發現隨著溫度的升高，各主成分峰的峰面積逐漸變大，但在80 ℃之后基本不變，考慮到溫度越高，越易產生干擾峰，確定平衡溫度為80 ℃。在80 ℃下，通過平衡不同時間發現，在30 min時，所要研究的溶劑已全部檢出，且峰面積大，分離度較好，所以確定平衡時間為30 min。

理論板數以乙醇計應不低于10000，11中化合物全部分離，色譜圖見圖1。

2.2 溶劑的優化

樣品經過優化的提取條件提取后，選用MCX固相萃取小柱對目標物進行凈化，MCX柱填料克服傳統硅膠基質混合型固相萃取吸附劑的局限性，利用頂空進樣方式進行樣品殘留溶劑的檢測常用的溶劑主要為水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜及其他適宜溶劑。由于大豆異黃酮提取物在水中不易溶解，易溶于DMSO，故以DMSO作為溶劑，結果顯示待測各成分的峰形好，分離度符合要求，對測定結果不產生干擾。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

空白基質的制備：按照“1.2.2”項下制備空白基質。

精密量取混合標準貯備液，用空白基質稀釋成系列標溶液，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得線性方程及相關系數，方法檢出限及重復性見表1。

2.4 回收率實驗

精密稱取已測定各有機溶劑殘留量的大豆異黃酮提取物樣品9份，各約1 g，分別置于10 mL量瓶中，精密加入已知量混合對照品溶液，每個質量濃度3份，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，各精密量取5.0 mL，置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封，按“1.2.3”項下方法進行測定，結果見表2。

2.5 實際樣品測定

取11批大豆異黃酮提取物樣品各1 g，精確稱定，置10 mL量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5.0 mL置20 mL頂空瓶中，加蓋密封，按“1.2.3”項下方法進行測定。11批購自不同生產廠家的樣品檢出的溶劑殘留有甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮。其中有1批樣品的甲醇超標，3批乙醇超限，其他各有機溶劑殘留量均在限度范圍內，2020年版《中國藥典》四部規定的溶劑殘留限量見表3。

3 討論

1批樣品檢出甲醇，甲醇為二類溶劑，主要原因可能為乙醇中的甲醇殘留或為降低成本直接使用含大量甲醇的工業酒精提取甚至直接使用甲醇提取。乙醇由于是工藝中正常引入，為三類溶劑，毒性較小，環境污染小。由于目前市場上大豆異黃酮沒有統一的質量標準，所以本實驗分別同11個不同的生產廠家采購樣品，以考察市場上大豆異黃酮提取物有機溶劑殘留的情況，從實驗結果看出大豆異黃酮甲醇和乙醇限量存在一定超標的風險，因此，制定大豆異黃酮提取物有機溶劑殘留的限量十分必要。

【參考文獻】

[1] 郭嘉.大豆異黃酮的營養探究[J].現代食品，2016（18）：32-33.

[2] AHUJA V，MIURA K，VISHNU A，et al. Significant inverse association of equol-producer status with coronary artery calcification but not dietary isoflavones in healthy Japanese men[J].British Journal of Nutrition，2017，117：260-266.

[3] 范兆軍.大豆異黃酮的提取技術[J].科技信息，2011（16）：588-589.

[4] 王丹.脫脂豆粕中大豆異黃酮提取工藝的研究[J].食品研究與開發，2017（6）：52-55.

[5] 盧丞文，王玲.大豆異黃酮提取方法的研究進展[J].吉林農業月刊，2017（8）：111-111.

[6] 彭游，余盛祿.大豆異黃酮提取研究最新進展[J].大豆科學，2012（2）：320-323.

【作者簡介】

白旭東（1973-），男，副主任中藥師，學士，研究方向為食品，藥品和醫療器械的檢驗與審評。

周兆梅（1965-），女，教授級高級工程師，學士，研究方向為保健食品檢驗。

黃媛（1983-），女，碩士，研究方向為食品檢驗與食品安全。

通訊作者：谷巖（1975-），女，碩士，研究方向為食品檢驗與食品安全，E-mail：591131710@qq.com。