蛋白質組學技術在骨性關節炎發病機制中的應用

范春博楊永菊關雪峰*

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽110847；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110032)

1 骨性關節炎

骨性關節炎(Osteoarthritis，OA)是全球最常見的運動系統疾病，也是一種致殘率較高的疾病[1]。多見于中老年人群，主要表現為受損關節疼痛，可伴關節腫脹?；魏突顒邮芟薜龋±硖攸c是關節軟骨破壞。軟骨下骨硬化。骨贅形成和滑膜炎癥[2]。其發病機制尚未清楚，目前國內外沒有任何治療手段能夠顯著控制其發展。同時也缺乏早期診斷方法[3]。因此尋找OA的發病原因。致病因子等成為了學者們研究的重點方向。

2 蛋白質組學技術

蛋白質組學(Proteome)的概念是1994年在意大利召開的雙向電泳會議上澳大利亞學者Pandey和Mann[4]首次提出來的“一個基因組所表達的蛋白質”，1996年再次提出“在一定條件下，在某一個生命體系中由基因組編碼的全部蛋白質，即某一物種、個體、器官、組織乃至細胞的全部蛋白質”。蛋白質的空間結構和特異功能影響著生命個體的活動機制及外在表現。很多生物基因組中的蛋白質編碼基因已被人類識別，但是蛋白質的表達并不穩定，蛋白質合成過程中產生了大量的蛋白質變體(proteoform)[5]，隨著科學研究的深入蛋白質的研究方式已經無法滿足科學活動要求，蛋白質組理念的提出以及一系列技術的發展則為蛋白質的研究提供了基礎。蛋白質組學主要由蛋白質的分離技術、生物質譜技術和生物信息學組成[6]，新一代的抗體蛋白芯片技術也在逐步被研究者們所認可。當今蛋白質組學在生命科學領域發展迅速，為人類了解疾病的發生及發展的過程提供了新途徑，新方法。

3 蛋白質組學技術在OA發生機制研究中的應用

3.1 蛋白質分離技術 蛋白質分離技術主要包括二維電泳技術、同位素標記相對和絕對定量技術、高效液相色譜技術[7]。

3.1.1 二維電泳技術 早期的蛋白質分離技術是二維電泳技術，原理比較簡單是利用蛋白質分子量及等電點的不同，進行二次雙向電泳蛋白質分離，但缺點也很明確，不能分離分子量很大或者很小的蛋白質同時技術難度大。工作周期長[8]。其中將二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術與等電聚焦技術相結合所形成的二維電泳是目前分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。廖偉雄[9]通過行關節鏡診治的12例KOA患者與12例非KOA膝關節疾病患者(半月板損傷10例，盤狀半月板2例，均無明顯關節軟骨損傷)關節滑液標本，應用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳發現組織相容性白細胞抗原-DR(HLA-DR)、結合珠蛋白在KOA中表達上調，且與病情嚴重程度高度相關。Henrotin[10]等采用2D-DIGE技術對年輕健康志愿者與晚期關節炎患者進行對比研究.分析樣本數據，在OA組發現了13種差異蛋白，運用免疫測定法發現Fib3-1、Fib3-2血清水平明顯高于健康對照組，由此推斷Fib3肽類是OA的潛在的標志物。

3.1.2 同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tag for relative absolutequantitation，iTRAQ)，則通過將蛋白質酶解為肽段，利用iTRAQ試劑與肽段的氨基或Lys的ε-氨基發生反應等量混合，再將標記的樣本互相混合后，通過串聯質譜進行分離鑒定[11]。梁海波[12]收集膝關節骨性關節炎患者60例，參照Kellgren-Lawrence(K-L)分級標準，分為 k-L0、I I、IV級的亞組，每個亞組隨機選取10例男性與10例女性進行穩定同位素116、117、118的 iTRAQ標記。通過對不同樣品的iTRAQ膚段實驗標記共篩選出有意義差異蛋白169個。Fernández-Puente等[13]采用iTRAQ聯合(MALDI)-TOF/TOF的方法，通過比較正常對照人群和OA中的血清樣本，發現了300余種重復性和特異性很高差異蛋白，其中262種差異蛋白可以量化并計算其iTRAQ比，發現OA潛在生物標志物包括如脂蛋白、血管性血友病因子、軟骨寡聚基質蛋白和四連接素等。

3.1.3 高效液相色譜技術 液相色譜技術得到了全面發展，氣相色譜、液相色譜相互結合使用，可以高效的分離復雜的蛋白質復合物及肽段，造就了了自動化、高通量的檢測手段，在蛋白質組學中得到廣泛應用，但在OA研究中此項技術還未普及，將來可以列入OA炎性因子的篩選。對于完整蛋白質的分離與鑒定，Kelleher[14-15]所建立的四維離線分離平臺就是利用蛋白等電位點的差異，通過對凝膠洗脫液相離截留電泳的離線分離，Ljiljana[16-17]則使用弱陽離子交換結合親水交互液相色譜的在線分離方法也實現了完整蛋白質的高通量分離。

3.2 生物質譜技術 生物質譜技術在蛋白質組學中的應用越來越廣泛，其中離子化技術和質譜儀是質譜技術的核心。高速運轉的待測樣本中的離子擁有不同的質荷比(m/z)進而分離和檢測目標離子或片段，然后依據保留時間、豐度值進行定性和定量[18]。20世紀后期，電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)和基質輔助激光解吸附離子化(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)兩大生物大分子離子化技術在電離時能夠保持分子的完整性，由此大規模的蛋白質機械化鑒定成為可能，兩者成了質譜離子化的重要手段，生物質譜技術也因此成為了蛋白質組學的一項支撐技術[19]。相比較這兩種離子化技術各有千秋，ESI-MS與液相色譜聯用則可用于分析復雜樣品而MALDI適用于分析簡單的肽混合物。質譜的質量分析器包括四種分析器都有自己的特點，根據不同的科研要求，各種質量分析器相互雜交形成了串聯質譜儀。余光書[21]等采用定量蛋白質組學串聯質譜標簽標記技術，檢測軟骨組織標本取材于70-75歲行膝關節表面置換術的骨性關節炎患者的膝關節軟骨組織，并提取線粒體。通過數據庫檢索得到294個蛋白質點的蛋白質有ATP合酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脫氫酶1等14種蛋白質存在于此線粒體對軟骨細胞線粒體中的蛋白質作全面的定性觀察。SINZ[22]等運用質譜測定法(MS)研究類風濕性關節炎、骨性關節炎患者的滑膜液和血漿，發現只在類風濕性關節炎患者的滑膜液中存在鈣粒蛋白B，而血清淀粉蛋白A也只在類風濕性關節炎患者的血漿和滑膜液中被發現。MATSUO[23]等使用雙向和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術相聯合在骨性關節炎患者血清中鑒定出fibulin-4蛋白。

3.3 生物信息學技術 生物信息學是由計算機科學與應用數學、生物學等多種學科相互融合而形成的。它把DNA序列信息分析作為源頭，對蛋白質的序列分析。結構分析。功能分析、點突變的設計及家族鑒定等進行研究。在獲得蛋白質編碼區的信息后進行蛋白質空間結構模擬和預測，運用計算機軟件對所獲得的實驗數據進行存儲及加工，然后利用先進的數據庫分析，進行統計驗證，從而獲取數據所蘊含的生物學信息[24]。當今生物信息技術在OA方面研究還不夠深入，研究者沒還沒有充分利用此學科進行OA的研究，OA的病因還未明確，所獲得蛋白質的種類還未具體，蛋白質數據庫還不夠完善，這使OA的蛋白質組學的研究遇到了瓶頸。但是隨著科技的進步，計算機算法及軟件的快速更新、蛋白質數據庫的不斷完善都為OA蛋白質組學的研究發展提供了動力，綜合各個方面的生物信息學必將成為揭示OA蛋白質密碼的金鑰匙。

3.4 抗體蛋白芯片技術 抗體蛋白芯片技術是新的蛋白檢測技術。是建立在蛋白組學基礎上的，應用抗體芯片(alltibody microarray，抗體微陣列)檢測生物樣品中蛋白表達模式的新方法[25]?？贵w芯片技術的目的主要是通過檢測不同病理組織的差異蛋白，通過發現的差異蛋白逆向推測疾病的演變過程，進一步指導臨床用藥及疾病的診斷與預防?？贵w蛋白芯片技術的基本原理是將有需要的抗體固定于各種載體上作為待檢測的芯片，之后用用標記了特定熒光抗菌素體的蛋白質或其他成分與芯片發生反應[26]，漂洗洗去未能與芯片上蛋白質互相結合的成份，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關系，由此達到測定各種蛋白質功能的目的[27]?？贵w芯片中的抗體有單克隆抗體和重組抗體。目前，比較普及的新一代的抗體蛋白芯片產品和技術，包括膜式和玻片式蛋白芯片，以及成套的ELISA試劑。蛋白芯片分為膜式和玻片式蛋白芯片，前者可以使用和Western blot相同的成像系統進行檢測，極大的降低了蛋白芯片的使用門檻。玻片式蛋白芯片還有可定量的類ELISA的蛋白芯片，可在普通的激光可聚焦掃描儀上使用，可以極大的降低細胞因子的檢測成本，適合于多指標(幾十個到上百個指標)，小樣本或者中等樣本的檢測。柴藝匯等[28]使用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測黃芪多糖對MC-3T3-E1成骨細胞CYP24A，CYP27B蛋白的表達情況。結果發現示黃芪多糖的質量濃度在0.1，1，10mg-1時可以提高MC-3T3-E1成骨細胞的繁殖率且在48h促增殖作用最佳。新一代的抗體蛋白芯片適用方便，檢測率高。目前在OA方面研究應用還不太廣泛未來可廣泛應用于OA的研究中。

4 總結與瞻望

蛋白質組學技術發展迅速，潛能巨大，緊隨著蛋白質譜技術的創新進步，準確性、靈敏性及覆蓋性方面均在不斷提升。盡管目前蛋白質組學仍存在著，如研究芯片造價高、質譜結合率低等問題，但仍然是OA研究中新興的技術方法。未來以蛋白質組學為手段研究OA的疾病過程會更加的普遍。同時蛋白質組學對OA研究應該以臨床大樣本為對象，從大樣本進行分析篩選驗證，從而尋找OA明確的生物標志物。同時單一的蛋白質組學難以解決更深層次OA的相關問題，將蛋白質組學與基因組學、轉錄組學和代謝組學等分子生物學結合可以更加立體直觀的了解OA的發生發展機制。因此應以蛋白質組學做為橋梁，尋找OA的發病原因，以分子生物學做為基礎深入研究，可在未來為人來研究OA的發生及發展機制提供更多的途徑與方法。