基于SRAP分子標記的24個黑木耳栽培菌株遺傳分析

史靈燕 張云龍 劉保衛 鄭素月

（河北工程大學園林與生態工程學院，河北邯鄲056021）

黑木耳（Auriculariaauricular）又名木耳、光木耳、云耳、黑耳子等，是我國著名的食用菌，食藥用價值高，在我國栽培歷史悠久。隨著食用菌市場的發展，現存市場相互引種頻繁，私自命名菌種繁多，種源不清，名稱混亂，菌種混亂問題日益嚴重，菌種糾紛頻發，而食用菌產業在菌種知識產權保護方面意識較弱，菌種保護管理制度也不夠健全。隨著分子標記技術的快速發展，利用分子標記鑒定不同地區、不同黑木耳菌株的研究報道越來越多[1-5]，而利用SRAP（sequence-relatedamplifiedpolymorphism）分子標記鑒定生產中不同黑木耳菌株親緣關系的研究較少[1，6]。

SRAP分子標記是一種基于PCR的新型分子標記系統，目前廣泛地應用于植物的物種遺傳多樣性和親緣關系分析。相對于其他分子標記方法，SRAP分子標記在植物物種的遺傳多樣性和親緣關系分析中能獲得更多的信息[7]。該標記具有簡便、穩定、高重復率、便于克隆目標片段的特點，并已被應用于圖譜構建性狀的標記和遺傳多樣性分析[8]。SRAP標記技術已在木耳、平菇、香菇、靈芝、金針菇、雞腿菇、雙孢蘑菇、大球蓋菇等食用菌遺傳多樣性分析和親緣關系分析上得到應用[7，9-15]。筆者采用SRAP分子標記，對收集到的北方地區24株栽培中常用的黑木耳菌株進行遺傳多樣性分析，明確其菌株間的親緣關系，以期為生產上黑木耳菌株的選擇、菌種管理及其栽培育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑木耳菌株主要來源于東北黑龍江、吉林、遼寧地區及河北平泉地區，詳見表1。

表1 供試黑木耳菌株及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取、擴增和電泳檢測

將菌種活化后接種于平板上，25℃條件下進行隔膜培養。7d后取120mg新鮮菌絲體，液氮研磨成粉末，用植物基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分光光度計測定DNA濃度和質量，稀釋成50ng/μL，置于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 SRAP擴增反應體系

20μL反應體系中，2×TapPCRMasterMix 10μL，上、下游引物各1μL，模板DNA1μL，用ddH2O補足體積。

SRAP擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，35℃復性1min，72℃延伸1min，5個循環；94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，80V恒壓電泳45min，紫外凝膠成像系統觀察并拍照。

1.2.3 SRAP標記引物序列

SRAP引物序列見表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成，設計上游引物6條，下游引物8條，隨機組成48對引物組合。

表2 SRAP分子標記引物序列表

1.2.4 數據處理

電泳結果采取0/1賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現DNA片段的記為1，不出現的記為0，統計后輸入電腦，用聚類分析軟件NTsys進行聚類分析，并計算遺傳相似度。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA檢測

DNA電泳檢測結果見圖1。電泳條帶清晰且亮度高，說明所提取的DNA純度高，可以進行后續的研究工作。

圖1 部分黑木耳菌株基因組DNA圖譜

2.2 引物篩選結果

選擇較廣泛栽培的黑木耳黑豐菌株DNA對48對引物組合進行初步篩選，圖2為48對SRAP引物組合對黑木耳菌株擴增的指紋圖譜。結果表明，有25對SRAP引物都能清晰地擴增出條帶，且條帶較多。每對引物組合樣本的擴增帶數目在2～9條不等，平均每對引物擴增條帶6條，說明本體系擴增效率較高。用篩選出的背景和條帶都比較清晰的25對引物組合分別對供試的24個黑木耳菌株DNA進行擴增。25對引物分別為：Me1-Em2，Me1-Em3，Me1-Em4，Me1-Em7，Me1-Em，8；Me2-Em1，Me2-Em1，Me2-Em3，Me2-Em4，Me2-Em7；Me3-Em2，Me3-Em3，Me3-Em4；Me4-Em1，Me4-Em3，Me4-Em5，Me4-Em7；Me5-Em2，Me5-Em2，Me5-Em4，Me5-Em5，Me5-Em6，Me5-Em7；Me6-Em6，Me6-Em7。

2.3 黑木耳菌株的SRAP指紋圖譜分析

25對引物對24個黑木耳菌株共擴增出133個位點，片段大小在0.1～1.5kb，平均每條引物的擴增位點為6個，其中多態性位點59個，平均多態性比率為40.5%（表3），部分引物對的SRAP-PCR的擴增圖譜見圖3和圖4。24個菌株的聚類分析結果見圖5所示，結果表明，供試的24個黑木耳菌株遺傳相似系數在0.56～1.0，當遺傳相似系數在0.56時，24個黑木耳菌株分為2大類；第一類包括黑豐、黑29、黑威15號、大筋王、黑耳厚、厚筋6個菌株，其余黑威單片、黑威伴金、瑞寶、海元、黑三角等18個菌株為第二類菌株，說明每一類中這些菌株的遺傳背景相似，親緣關系比較近。其中，黑威15號、黑29和厚筋、黑耳厚、大筋王、黑豐之間的相似水平達98%；UR38、UR87、黑山與黑威單片、黑威伴金、瑞寶等15株菌株之間的相似水平也高達99%，表明其遺傳背景相近，也可能是由于市場混亂，屬于互相引種的同一個品種。

圖2 SRAP標記引物篩選擴增圖譜

圖3 Me4-Em3引物對擴增黑木耳菌株DNA圖譜

圖4 Me4-Em7引物對擴增黑木耳菌株DNA圖譜

表3 SRAP-PCR擴增條帶統計

圖5 24個黑木耳菌株的SRAP聚類分析圖

3 小結與討論

SRAP標記是一種基于PCR的新型標記系統，通過正反向引物對ORFs區域中內含子、啟動子進行特異擴增，因不同物種以及個體內含子、啟動子與間隔區序列長度不等而產生多態性[16]。研究利用SRAP分子標記法鑒定生產中常用的黑木耳菌株，具有重復性好，操作簡單，引物具有通用性，正反向引物可自由組合成引物對，引物使用率高，引物合成成本低的特點[17]，但與ISSR分子標記相比多態性較低[18]。SRAP技術目前廣泛應用于食用菌的菌株分子鑒定、分類學研究、遺傳多樣性及親緣關系分析等方面[7，9-15]，為食用菌遺傳學研究和育種提供了依據。劉華晶等[9]利用SRAP技術對大興安嶺地區野生黑木耳菌株進行遺傳多樣性分析。利用SRAP法對黑木耳生產菌株進行鑒定和遺傳分析，旨在澄清黑木耳市場菌種混雜退化，解決生產中常用黑木耳菌株的同物異名和同名異物的問題。本研究中，從生產中收集的24株黑木耳菌株經SRAP分子鑒定，PCR擴增獲得133個擴增位點，片段大小0.1～2.0kb，平均每條引物的擴增位點為6個，25對引物的133個擴增位點中，59個位點具多態性，平均多態性比率為40.5%，多態性豐富度較低；在遺傳系數0.56時分為了兩大類，第一類包括黑豐、黑29、黑威15號、大筋王、黑耳厚、厚筋6個菌株；第二類包括黑山與黑威單片、黑威伴金、瑞寶等18個黑木耳菌株。而黑29與黑威15號、厚筋與黑耳厚、大筋王、黑豐；UR38、UR87、黑山及其余15株菌株的遺傳相似系數為1.0，表明它們相互間不存在遺傳差異。

經SRAP分子標記技術鑒定生產中常用黑木耳菌株，結果表明生產中常用的黑木耳栽培菌株多態性較低，聚類分析分類也較少，從而進一步說明了生產中黑木耳栽培菌株存在同物異名現象。