結直腸癌化學性放射增敏劑的研究進展

彭湃瀾，廖斐綜述 董衛國審校

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)的發病率每年都在增加，2015年中國癌癥統計數據顯示我國結直腸癌的發病率、死亡率在全部惡性腫瘤中排名第5位，多數患者發現時已處于中晚期[1]。對于局部腫瘤病灶外侵固定無法手術或手術無法切凈的病例，臨床上通常在術中術后對腫瘤進行局部放療[2]。對CRC進行放射治療的主要難點包括腫瘤的放射抵抗性、腸周圍正常組織器官對放射線的耐受性等問題，這些影響了放療劑量的給予，限制了放療在結直腸癌治療中的應用。因此，需要進一步探索結直腸癌對放射治療反應的潛在機制，尋找一些有前途的放射增敏劑來增強輻射對腫瘤組織的損傷。

放射治療(radiation therapy ，RT)的基本原理是電離輻射(ionizing radiation，IR)與腫瘤細胞內物質通過直接和間接損傷效應兩種途徑產生相互作用。在電離輻射作用下，可直接損傷一些生物分子，例如蛋白質和類脂質，尤其是DNA，它是IR的首要效應物。DNA遭到破壞后可導致細胞分裂和周期阻滯，甚至出現細胞凋亡壞死。間接效應則是通過自由基破壞生物分子，很大程度上是由活性氧(ROS)通過化學反應導致生物分子的結構破壞，例如DNA的單鏈斷裂(SSBs)或雙鏈斷裂(DSBs)以及DNA-DNA或DNA-蛋白質的交聯，導致細胞死亡[3-4]。當細胞出現DSB后還可出現多種修復途徑以維持基因組的完整性并防止錯誤修復和染色體重排[5]?；谏鲜鯠NA損傷和修復的機制，促進了各種放射增敏劑的發展。根據不同的成分及結構，將放射增敏劑分為3類，即化學性放射增敏劑、分子放射增敏劑和納米放射增敏劑。本文按DNA損傷修復的不同作用機制分類，就近年化學性放射增敏劑在結直腸癌中的研究進展作一綜述。

1 直接損傷途徑：協同效應

奧沙利鉑是烷基化抗癌藥物家族中的鉑類化合物，通過與DNA的雙鏈結構之間形成加合物，干擾DNA的生物合成而產生抗腫瘤活性。奧沙利鉑還可通過誘導G2/M細胞周期停滯，阻斷DNA復制和抑制轉錄等機制增強輻射誘導的細胞毒性，最終出現協同效應誘導不可逆的DNA損傷[6]。奧沙利鉑作為放射增敏劑目前已進入I～III期臨床試驗，幾項I期和II期研究對奧沙利鉑加入標準放化療方案中的治療效果進行了評估，其結果顯示治療方案中化療藥物的毒性反應增加，而沒有取得額外的治療益處[7-8]。作為第三代鉑類藥物，奧沙利鉑目前已被批準用于結直腸癌的治療[9]，但目前對直腸癌的標準治療未將奧沙利鉑加入術前新輔助放化療方案，在報告III期臨床試驗數據后，該建議可能會得到改變。

2 間接損傷途徑：自由基損傷

放療時產生的間接效應很大程度上是由活性氧產生ROS引起的。 ROS通過破壞生物分子和激活相關信號通路而促進腫瘤細胞發生凋亡[10-12]。含有兩個不成對電子的氧可以被歸類為自由基，是放射增敏劑的原型。氧可以快速添加到許多其他自由基中，增強生物分子的損傷反應，產生新的反應性自由基，并且促進級聯反應。另一方面，包括結腸癌在內的大多數實體瘤均存在乏氧區域，缺氧期間可用的氧分子降低，減少ROS的產生，減弱DNA損傷效應，這是腫瘤組織對放療產生抵抗的一個主要生物因素。低氧合的實體瘤通常比良好氧合(含氧量正常)的腫瘤更耐放射線，需要更高劑量的IR用于治療[13-15]。因此，改善腫瘤對放療敏感性研究的另一策略是將缺氧細胞作為腫瘤特異性靶標，用于改善對電離輻射的反應性。

2.1 氧及其模擬物 氧氣具有電子親和力的特性，是較早提出的一種放射增敏劑，根據這樣的特性，在該領域研究的早期階段也常常尋找一些具有相同特征和相似功能的小分子化合物。一些以氧自由基為基礎而開發的化合物顯示出了臨床應用前景，部分已經在臨床上得到了使用。

常規放療的治療效果是在電離輻射作用下，由水的放射分解所產生自由基的間接作用來實現的，然后是生物體的破壞。而由自由基引起的生物分子病變可以通過還原劑來修復，例如含有巰基的谷胱甘肽(GSH)，它是一種中和細胞內自由基的供電子基團。如果存在氧氣，它將增強損傷并提高RT的效率，而氧模擬物(主要是含硝基化合物)具有電子親和力，能夠以類似于氧的方式固定自由基引起的生物分子損傷。在大多數常見類型的實體瘤，包括結直腸腫瘤中發現的低氧區域大大限制了RT的作用。因此，在結直腸癌的放射治療中，氧氣及其模擬物可以用作放射增敏劑[16]。

電子親和放射增敏劑的原型是硝基苯，其后研究重點轉向硝基咪唑，并發現或合成了大量的衍生物[17]。已知和最早開發的化合物是米索硝唑，這是一種2-硝基咪唑，對幾乎所有固體小鼠腫瘤都具有放射增敏作用。

2.2 靶向缺氧細胞 由于在大多數實體瘤中可出現缺氧區域，而缺氧腫瘤細胞通常表現出放射抗性，因此，缺氧細胞是用于改善對電離輻射響應有吸引力的腫瘤特異性靶標。有研究檢測活性氧供體雙氫青蒿素(DHA)在常氧和嚴重缺氧中人結腸癌細胞系中的抗腫瘤活性。DHA有效降低常氧和缺氧條件下HCT116細胞的克隆形成存活率，但兩種條件下DHA所誘導的細胞凋亡或壞死未見明顯差異。在這兩種條件下，活性氧物質的產生是DHA誘導毒性的重要介質。進一步的分子分析表明，DHA介導的細胞死亡涉及不同組的促凋亡Bcl-2家族成員。 DHA在嚴重缺氧和常氧中均具有顯著細胞毒活性，為靶向缺氧腫瘤細胞以改善癌癥患者的治療效果提供新的觀點[18]。

2.3 缺氧與放療敏感性 在缺氧狀態下，可出現一種在進化上較為保守的細胞內反應，稱之為細胞自噬，據報道自噬參與腫瘤對放療的抵抗，可同時誘導腫瘤細胞出現抗輻射效應[19]。Sun等[20]對于低氧條件下結腸癌細胞自噬以及對放射敏感性影響的作用機制進行了相關研究。發現在低氧條件下缺氧誘導因子(HIF-1α)和miR-210的表達顯著增加，而抑制 HIF-1α的表達后也降低了miR-210的表達和自噬。 miR-210的沉默上調了Bcl-2的表達，并降低了放療后結腸癌細胞的存活分數。在缺氧條件下，HIF-1α可誘導miRNA-210，從而增強自噬并通過下調結腸癌細胞中Bcl-2的表達來降低放射敏感性。

腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是腫瘤微環境的主要成分，對腫瘤生長、浸潤和轉移過程至關重要，并有助于耐藥性的產生。有研究調查了TAMs自噬調節對結直腸癌細胞放射敏感性的影響，在與LoVo結直腸腺癌細胞共培養期間，通過刺激TAM促進或抑制自噬。對細胞進行照射后測量LoVo集落形成和細胞凋亡，發現TAMs中自噬的上調抑制了結腸癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡，并改變了放射敏感性相關蛋白的表達。研究表明結腸直腸癌細胞的放射敏感性與TAM的自噬有關，并且刺激TAM自噬可以增加結直腸癌細胞的放射敏感性[21]。

3 DNA修復途徑

研究發現與細胞DNA修復有關的多種信號途徑可能影響RT的有效性。因而調控這些重要途徑的化學物質，如DNA修復抑制劑對放療可以起到增強效應。已發現多種信號通路與放射敏感性相關，如HDAC4，c-MET-PI3K-Akt、PI3K-Akt-mTOR等[22-24]。而BEZ235是一種雙重PI3K-mTOR抑制劑，可增強結直腸癌細胞的放射敏感性[25]。

3.1 抑制損傷修復蛋白

3.1.1 蛋白酶抑制劑： 胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,TS)參與體內DNA生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成過程, 是該過程的限速酶。臨床上用于靶向胸苷酸合成酶(TS)的化學治療藥物包括氟嘧啶(FPs)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和5-氟-2'-脫氧尿苷(FdUrd)。含有5-FU的放化療治療方案已被證明可改善食管癌和胃腸癌等腫瘤的局部控制，并被認為是胃腸腫瘤的標準治療方法之一。

研究對使用慢病毒遞送的shRNA和FdUrd所介導的TS失活在HCT116和HT29兩種結腸癌細胞系中的細胞毒性、放射增敏和檢查點激活等分別進行比較，發現TS shRNA產生的細胞毒性低于FdUrd，但對放射增敏腫瘤細胞同樣有效。因此，FdUrd對TS單獨的抑制作用足以引起FdUrd的放射增敏作用，研究支持TS抑制可作為一種新型放射增敏策略而進一步探索[26]。

有學者對5-FU聯合甲氧胺(Mx)對人結腸癌細胞系在經γ射線處理后所引起的細胞毒作用和DNA損傷的影響進行了實驗研究。首先給予1 mmol/L濃度的Mx聯合5-FU處理細胞，未見其在細胞毒性和DNA損傷方面有顯著影響。然而，當與2 Gy γ射線聯合使用時，不同濃度5-FU對細胞的毒性作用得到加強。細胞毒性和DNA損傷隨著5-FU藥物濃度的增加而增加，由此提出Mx聯合5-FU可增強結腸癌細胞的放射敏感性[27]。為了使5-氟尿嘧啶對放射增敏的作用達到最大化，通常認為5-FU必須長期和低劑量給藥。Valdes[28]針對人結腸癌細胞系HCT-116 設計了細胞實驗，將5-FU以低劑量慢性(LDC)和高劑量脈沖(HDP)2種方式分別給藥，發現在HDP方式下給予5-FU與當前常用的LDC給藥模式相比具有更強的放射增敏效應，HDP 5-FU給藥對于高放射抵抗性的HCT-116細胞具有放射增敏作用。 此外還發現如果細胞在HDP 5-FU暴露后立即用2 Gy預照射，由于后續照射的亞致死損傷修復能力下降，這種放射增敏作用持續時間≥24 h。這表明高劑量脈沖注射5-FU與分次放射治療的聯合方案為比較理想的組合，對于臨床用藥方面具有較強的指導意義。

環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成的限速酶，環氧合酶-2(COX-2)作為一種炎性介質，其活性與正常組織中ROS產生及炎性信號相關。COX-2的過表達在腫瘤的發生、侵襲、轉移中扮演著重要的角色[29]，在電離輻射中，可通過旁觀者效應的現象進一步放大輻射細胞以及相鄰細胞的輻射毒性。此外，在腫瘤中該酶的活化可以增加惡性細胞對放射療法的抗性。因此，已經提出抑制COX-2以獲得更好的治療反應，COX-2抑制劑塞來昔布是用于放射增敏和輻射防護研究最多的COX-2抑制劑之一[30]。在人結腸癌細胞HCT116中未檢測到COX-2的表達，研究發現用塞來昔布治療顯著增加COX-2陰性HCT116細胞中的BCCIP(BRCA2和CDKN1A相互作用蛋白)表達。 BCCIP的敲除明顯消除了塞來昔布誘導的HCT116細胞增強的放射敏感性。塞來昔布與放射治療聯合處理細胞，可誘導更高水平的放射損傷相關蛋白磷酸化，G2/M停滯以及細胞凋亡而增強HCT116細胞的放射敏感性。塞來昔布通過上調BCCIP的表達影響p53的功能并抑制輻射誘導的損傷恢復[31]。

3.1.2 蛋白激酶抑制劑： 一些蛋白激酶抑制劑被開發出來用于特異性靶向抑制參與細胞損傷修復途徑的蛋白質，從而使癌細胞對輻射敏感。蛋白激酶是催化蛋白質磷酸化的一組結構各不相同的酶，在基因表達的調節中起著關鍵的作用。蛋白激酶抑制劑根據抑制蛋白激酶的種類分為絲/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑和酪氨酸蛋白激酶抑制劑。

在人類細胞中，有2種主要途徑負責DSB修復;第一種是非同源末端連接(NHEJ)重新連接DNA斷端，這種修復機制是由DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)復合物誘導的；第二種是同源重組(HR)，其中使用完整的同源DNA序列來精確修復DSB[32]。特異性靶向抑制參與這些修復途徑的蛋白質，由于抑制了細胞的修復機制而使癌細胞對輻射的敏感性增加。這不但增強了放射治療效果，還可以使照射劑量最小化，在治療效果最大化的同時讓放射不良反應降到最低。最近，吡喃酮NU7026和色酮NU7441已被開發為特異性DNA-PK抑制劑并且正處于臨床前試驗[33]。近來的研究發現2種新型苯并惡嗪衍生物LTU27和LTU11B具有放射增敏作用。已顯示LTU27對LY294002和NU7026具有與DNA-PK抑制劑相當的抑制效力，而LTU11B的DNA-PK抑制IC50高出一個數量級[34]。研究測試了這些化合物在結直腸腺癌細胞HT29中的放射增敏作用，結果發現這些化合物通過抑制DNA-PK導致延遲的DNA修復和促進細胞凋亡，具有強效放射增敏效應[35]。

酪氨酸激酶抑制劑博蘇替尼可通過調節DNA損傷檢查點提高腫瘤細胞的藥物敏感性。有研究將博蘇替尼與放療結合來處理人類結腸癌細胞系HT-29，通過克隆形成法測定細胞存活的數據表明，博蘇替尼可以提高HT-29細胞對放射治療的敏感性，但需進一步量化博蘇替尼的放射增敏作用[36]。

索拉非尼(Nexavar，BAY43-9006)是一種口服多激酶抑制劑，可阻斷腫瘤細胞增殖和血管生成，并通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶誘導腫瘤細胞凋亡，研究者將3種人類結腸直腸腺癌細胞系(HCT116、HT29和SW480)單獨用索拉非尼以及輻射后用索拉非尼進行治療進行了對比研究。證實索拉非尼增強了輻射的抗增殖作用，減少了集落形成，增加了腫瘤細胞在G2/M期阻滯并增強了活性氧輻射誘導的細胞凋亡。索拉非尼還通過阻斷DNA依賴性蛋白激酶激活抑制輻射所誘導的DNA損傷修復。聯合治療顯著抑制體外腫瘤細胞遷移，腫瘤細胞侵襲和血管內皮生長因子介導的血管生成[37-38]。

3.2 DNA修復的表觀遺傳調控 基因表達的表觀遺傳調節不包括基因擴增、突變等DNA序列的變化，其調控可逆，通常由DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑等機制介導。腫瘤細胞中影響細胞死亡和存活信號傳導的表觀遺傳改變可以使腫瘤細胞逃脫分子靶向藥物及電離輻射等所導致的細胞毒性作用[39]。因此，通過對這些基因的表觀遺傳調控過程進行抑制，可以調節腫瘤細胞對放射治療的應答反應，為放療增敏劑的發展提供了不同的策略。

3.2.1 DNA甲基化： DNA甲基化是參與調節癌細胞中基因表達調節的關鍵表觀遺傳過程，抑制DNA的甲基化可能是有效的癌癥治療策略。DNA甲基化引起的基因表達改變會影響放射治療的應答性，由此推斷DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)可能對腫瘤細胞的放射敏感性產生影響。有研究對結腸癌細胞HCT116分別給予單獨的照射治療，單獨5-aza-dC治療以及用5-aza-dC與照射治療組合處理，可見組合處理方式顯著降低了腫瘤細胞的生長活性。與單獨處理相比，當用放射聯合5-aza-dC處理細胞時，處于G1期中HCT116細胞的百分比和其凋亡率增加，表明5-aza-dC增強結腸癌細胞的放射敏感性，與放療聯合有可能成為治療結腸癌的臨床策略[39]。

3.2.2 組蛋白修飾： 組蛋白去乙?；?HDAC)從賴氨酸殘基中去除乙?；?，導致染色質濃縮和基因的轉錄失活[40]。HDAC抑制劑現已被開發作為癌癥或癌癥的輔助治療。曲古抑菌素A(TSA)是一種經典的組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)，能特異性抑制HDAC的生化功能，并被證明是一種有效的抗癌藥物。近來還發現TSA可在結腸癌細胞中誘導自噬反應，而自噬抑制導致細胞凋亡并增強結腸癌細胞的放射敏感性。此外，研究數據表明TSA還抑制細胞保護性自噬而使癌細胞對輻射敏感[41]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸在臨床上通常被用作抗驚厥藥物和情緒穩定藥物。然而，丙戊酸也被證明在照射后抑制HDAC酶活性并增強腫瘤細胞的放射毒性[42-43]。該抑制劑可增加P53缺失結腸癌HCT116細胞中腫瘤抑制蛋白P21蛋白的表達以及激活檢查點激酶2(CHK2)的活性水平，其放射增敏作用主要取決于CHK2的活性[44]。

4 聯合方案

為避免結腸癌治療過程中局部復發，常給予術前或術后額外放療。然而，放療主要是針對惡性腫瘤細胞，需要在增加惡性細胞放射敏感性的同時又不影響正常細胞的活性。在這種情況下，添加2種或2種以上的化學治療藥物作為放射增敏劑是放射生物學中的常見做法[45]。BI-69A11是一種ATP競爭性Akt抑制劑[46]，可通過抑制Akt磷酸化導致Akt-Hsp90的解離，從而導致結腸癌的細胞凋亡。最近的研究還表明，BI-69A11的抗腫瘤功效來自NF-κB和Akt通路的雙重靶向作用[47]。早期的BI-69A11在結腸癌中顯示出潛在的細胞凋亡誘導作用。而BI-69A11和塞來昔布組合使用，可抑制共濟失調毛細血管擴張癥(ATM)激酶以及負責電離輻射(IR)所誘導雙鏈斷裂(DSB)的修復基因DNA-PK的磷酸化。2種化合物的組合作用抑制了IR誘導的Akt和ATM下游靶標的激活，減弱了IR誘導的G2/M細胞周期阻滯。在調節促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的三聯療法治療后，這可能導致細胞凋亡途徑的誘導活化[45]。研究揭示了三聯療法在預防放射抗性方面的治療潛力。

5 放射增敏劑的其他進展

目前批準用于臨床的化療藥物的使用已經使化學放射療法成為一個有吸引力的方向，并創造多種方案，有助于抗腫瘤作用。其他類型的化學放射增敏劑，如假底物，影響細胞信號傳導的化學物質，靶向遞送系統以及抑制放射防護物質的化學物質等，也取得了一些進展，一些正處于臨床前評估階段。此外，隨著納米技術的發展，為理想的放射增敏劑的研究和開發提供了新的機會。憑借先進的合成方法，低細胞毒性，良好的生物相容性和易于功能化，出現了一些具有良好放射增敏效應和代謝特性的納米材料。此外，藥物遞送的新方法也可以改善放射增敏劑的功效[48]，可利用納米材料的載藥能力開發新的藥物遞送系統。生物技術藥物，如miRNA，新的途徑和新的放射增敏方案已被不斷發現。所有這些進步拓寬了這一領域的視野，并促進了放射增敏劑的開發應用[49-50]?？傊?，對于放射敏感性機制的不斷深入研究將為新型放射增敏劑提供靶點，跨學科研究將開發多靶點放射增敏劑或藥物組合，有望加速更多新型放射增敏劑的開發應用。