維生素K拮抗劑Ⅱ誘導蛋白在肝細胞癌中的應用進展

胡 迪 武文娟 王鳳超

1 蚌埠醫學院，安徽省蚌埠市 233000； 2 蚌埠醫學院第一附屬醫院檢驗科

在中國，癌癥發病率和死亡率一直在上升，這使得癌癥成為2010年以來死亡的主要原因。原發性肝癌是原發于肝臟的上皮性惡性腫瘤，是全球第二大常見的癌癥死亡原因，肝細胞癌(HCC)占原發性肝癌的90%以上。目前肝癌的早期篩查主要依靠肝臟超聲和AFP。但是多數HCC患者一經確診，已屬晚期，易錯過最佳治療時期。異常凝血酶原或維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導蛋白具有早期診斷HCC敏感性、特異性高等特點，本文通過對PIVKA-Ⅱ的生物學概況及臨床應用兩方面進行綜述。

1 生物學概況

1.1 PIVKA-Ⅱ的發現 在20世紀30年代，維生素K因參與止血作用被發現。直到1974年，維生素K對止血作用的機制才被證實[1]。凝血酶原在維生素K的存在下，其1個或數個谷氨酸(Glu)殘基羧化為γ-羧基谷氨酸(Gla)，成為有活性的正常凝血酶原。因為Gla的存在使正常的凝血酶原可以與鈣離子結合,參與凝血過程[2]。Stenflo等人的觀察性研究表明，維生素K拮抗劑誘導的異常凝血酶原缺乏這種羧化的殘基，不能與鈣離子結合，不能參與凝血過程[1]。所以，異常凝血酶原被稱為脫γ-羧基谷氨酸(Des-gamma-carboxyprothrombin,DCP),也被稱為維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導蛋白(Protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)

1.2 PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌中的合成 1984年Liebman等人的研究發現，約90%的經活檢確診的肝細胞癌患者血清中可檢測到PIVKA-Ⅱ，且平均水平在900ng/ml，在正常對照組中未檢出，2例手術和1例化療后患者血清PIVKA-Ⅱ水平顯著下降，而在疾病復發時又升高[3]。Liebman的發現，讓人們對肝細胞癌血清腫瘤標志物有了新的認識，對肝細胞癌的早期診斷提供了幫助。但是，PIVKA-Ⅱ在肝細胞中產生的具體機制仍不明確。早在1985年的一項關于大鼠肝微粒體中維生素K代謝的研究指出，凝血酶分子在其N端有一個所謂的Gla域，其中包括10個γ羧化谷氨酸殘基。這些γ羧化谷氨酸殘基來自于凝血酶前體蛋白中的谷氨酸，是在肝細胞中通過維生素K依賴的羧化酶系統合成[4]。隨著時間的推移，仍有很多學者在繼續研究PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌中的產生機制。2017年，Taniguchi等人的實驗中通過培養不同的肝細胞癌細胞系，包括Huh-1、Huh-7、HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、HLF和HLE細胞系，用實時聚合酶鏈式反應檢測凝血酶原mRNA的水平，用電化學發光免疫分析法定量檢測DCP[5]。他們的研究表明肝細胞癌細胞系Huh-1、Huh-7、HepG2、Hep3B和PLC/PRF/5都是PIVKA-Ⅱ生成細胞系，而HLF和HLE細胞系不能產生DCP。而且，凝血酶原mRNA僅在DCP生成細胞中表達。他們得出，DCP的生成和凝血酶原mRNA的水平有密切的相關性。最終數據表明聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1[Poly-(ADP-Ribose) Polymerase-1，PARP-1]激活了凝血酶基因的轉錄，而過量的凝血酶基因轉錄誘導了肝細胞癌細胞系生成DCP。此項實驗也說明PARP-1抑制劑可能可以非常有效地治療肝細胞癌。

1.3 PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌中的生物學功能 雖然PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌中的生物學功能還不明確，已有很多學者從多角度出發，探討PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌增殖、血管生成等方面的影響。Suzuki M等人對PIVKA-Ⅱ作為肝細胞癌的一個潛在自體生長因子做了相關實驗，通過培養肝細胞癌細胞株，定量檢測、純化PIVKA-Ⅱ，采用細胞增殖培養、免疫印跡分析法、熒光素酶基因報告分析等方法對PIVKA-Ⅱ的生物學機制進行研究，他們指出，PIVKA-Ⅱ可與肝細胞生長因子(HGF)受體蛋氨酸(Met)結合，而Met表達于肝癌細胞株Hep3B、SK-Hep-1和HT-29中，并使Met絡氨酸殘基磷酸化，激活Met-JAK1-STAT3信號通路，從而促進HCC的增殖,而PIVKA-Ⅱ并不會影響Raf-Mek erk-MAPK信號通路[6]。2014年的一篇綜述中提到PIVKA-Ⅱ可能通過PIVKA-Ⅱ-KDR-PLC-γ-MAPK信號通路促進肝細胞癌血管生成[7]。

2 臨床應用

2.1 PIVKA-Ⅱ在HCC診斷中的作用 自1984年Liebman在HCC中發現PIVKA-Ⅱ開始，便有很多學者對其做了大量的研究。2015年，Poté N等人研究表明，在肝細胞癌早期診斷上，腫瘤標志物PIVKA-Ⅱ明顯優于傳統標志物AFP，并且有對肝細胞癌微血管侵犯(MVI)的預測作用[8]。而且，Yu R等人對10 738例HCC高風險患者進行定量檢測PIVKA-Ⅱ，最終有1 016例PIVKA-Ⅱ陽性(截斷值：40mAU/ml)患者(至少有2種影像學檢查或活檢病理結果)確診為HCC，占所有PIVKA-Ⅱ陽性患者的49.1%。而且,在已經確診的HCC患者中，有241例PIVKA-Ⅱ陽性，早期影像學檢查卻是陰性。結果表明，PIVKA-Ⅱ在HCC與非HCC的鑒別診斷上,PIVKA-Ⅱ的受試者曲線下面積可以達到0.8，明顯優于AFP[9]。張毅敏等人的研究結果表明，在肝癌組織中PIVKA-Ⅱ呈高表達，而且VitK2能夠降低肝癌細胞中的PIVKA-Ⅱ水平、抑制肝癌細胞生長、降低肝癌細胞侵襲能力[10]。在亞太肝細胞癌管理臨床實踐指南中提到，不推薦血清AFP作為小肝癌的診斷方法，腫瘤標志物的聯合檢測可提高其診斷HCC的敏感性，且其特異性并不會變的更低[11]。

2.2 PIVKA-Ⅱ動態監測在肝細胞癌肝切除術中的應用 目前對肝細胞癌患者的治療方法中外科治療仍是肝細胞癌患者能夠獲得長期生存的最有效手段[12]。經手術切除術的BCLC分期B/C、B和C的患者5年生存率明顯高于經TACE治療的患者(OR分別為：2.71、2.77、3.03；P<0.000 1)[13]。但是肝細胞癌患者術后的監測仍然很重要。Meguro M等人的研究中將2004年1月—2012年5月期間接受過肝切除術的205例患者(105例HBV感染、100例HCV感染)納入研究，進行回顧性分析，HBV和HCV感染者依據血清AFP和PIVKA-Ⅱ水平都被分為三組(兩者都高組HH、一高一低組HL、兩者都低組LL)，進行組間肝功能指標、術后無復發生存率、總生存率等的對比[14]。Meguro M等人的結果得出，HBV感染組中LL組、HL組、HH組平均無病生存時間：64.81±7.47 VS 36.63±7.62 VS 8.98±6.17(P=0.001)，平均總生存時間：85.30±6.55 VS 59.44±7.87 VS 46.57±11.20(P=0.018)；HCV感染組平均無病生存時間：50.09±5.90 VS 31.01±7.21 VS 14.81±3.08(P<0.001)，平均總生存時間：79.45±8.30 VS 58.82±7.56 VS 32.87±6.31(P<0.001)。很明顯，無論是HBV或HCV相關的HCC手術患者，高水平的AFP和PIVKA-Ⅱ預后都很差，AFP和PIVKA-Ⅱ是獨立的危險因素，與腫瘤的復發有關。 Feng X等人的研究指出PIVKA-Ⅱ對直徑>3.0cm的腫瘤具有較高的敏感性，而且，無論腫瘤大小如何，在HCC的診斷上，PIVKA-Ⅱ都較AFP是更好的選擇[15]。

2.3 PIVKA-Ⅱ動態監測在肝細胞癌肝動脈化療栓塞術中的應用 肝動脈化療栓塞術(Trans-catheter arterial chemo-embolization，TACE)是目前被公認的肝細胞癌非手術治療最常用方法之一。TACE治療后腫瘤標志物的監測對HCC患者的預后也是至關重要的。Arai T等人采用回顧性研究的方法，以腫瘤標志物的變化趨勢為基礎，對經TACE治療后復發肝癌患者進行療效評估，研究得出PIVKA-Ⅱ變化趨勢可能有助于評估復發肝癌患者TACE術后的治療效果[16]。此研究將484例經原發性肝癌切除術患者進行門診常規隨訪，每3個月做1次超聲檢查、檢測血清AFP和PIVKA-Ⅱ，每6個月查增強CT掃描，最終以出現HCC典型的影像學特征的新病灶診斷復發，其中162例復發后行TACE治療，最終142例患者納入研究。這142例患者每3～4個月進行1次CT或MRI的檢查，然后將TACE術前4周內和術后1個月內的動態增強CT進行對比，根據修訂版實體腫瘤療效評價標準(mRECIST)將術后療效評估為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)、疾病進展(PD)，總緩解率為CR+PR、疾病控制率為CR+PR+SD。同時用電化學發光法檢測對比TACE術前和術后1個月后第一次門診隨訪時血清AFP和PIVKA-Ⅱ，分為低水平組(術前和術后腫瘤標記物水平均低于其截斷值(AFP：100ng/ml和PIVKA-Ⅱ：100mAU/ml)、升高組(術后腫瘤標志物水平高于術前)、降低組(術后腫瘤標志物水平低于術前)。用Kaplan-Meier法計算TACE的總生存期(OS)，并用log-rank檢驗進行比較。單變量數據分析得出PIVKA-Ⅱ和AFP變化與OS之間存在相關性P<0.000 1，PIVKA-Ⅱ或AFP升高組，OS中間值越小。采用COX比例風險模型分析發現PIVKA-Ⅱ變化趨勢與總緩解率相關(P=0.009)和疾病控制率相關(P=0.004)，同時PIVKA-Ⅱ(高水平組 VS 低水平組：危險比8.47,95%可信區間4.54～15.84，P<0.000 1)可以作為生存的獨立預后因素。在HCC治療的臨床過程中，經常出現復發，而對于復發后的治療經常采用TACE術。2015年，Hiraoka A等人通過檢測腫瘤標志物AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ，將陽性腫瘤標志物(AFP≥100ng/ml；AFP-L3≥10%；PIVKA-Ⅱ≥100mAU/ml)數量作為TACE術后的預后評分，其中采用日本肝癌研究小組(LCSGJ)中提到的:TACE術后腫瘤標志物的持續升高作為TACE治療失敗的標志，研究結果指出腫瘤標記物陽性數量(≥2)是一個預測TACE術后反應的簡單方法，更加詳細的評估TACE治療無效HCC患者[17]。Ichikawa等人分別用化學發光酶免疫分析法和電化學發光法檢測TACE術前和術后1個月時的血清AFP和PIVKA-Ⅱ水平，聯合mRECIST對未行手術切除而行初步TACE術的HCC患者的生存時間進行早期預測[18]。其研究中設定術前AFP或PIVKA-Ⅱ基線水平為AFP≥200ng/ml或PIVKA-Ⅱ≥60ng/ml，積極的反應為術后1個月時較基線水平下降50%，最終分析結果得出AFP基線水平<200ng/ml的患者平均總生存時間(Overall survial,OS)明顯高于AFP≥200ng/ml的患者(29.4個月VS 6.1個月，P<0.000 1)，而在AFP≥200ng/ml的患者中，治療后AFP水平有無積極反應，對平均OS并無顯著影響(11.5個月VS 11.5個月，P=0.620)。比較PIVKA-Ⅱ基線水平發現，PIVKA-Ⅱ<60ng/ml與PIVKA-Ⅱ≥60ng/ml的患者，平均OS并無明顯差異(20.9個月VS 20.6個月，P=0.765)，而治療后PIVKA-Ⅱ有反應與較長的生存期顯著相關(67.0個月VS 19.8個月，P=0.020)。這些研究結果都能得出，TACE術后定期監測血清PIVKA-Ⅱ可以有效預測預后。

2.4 PIVKA-Ⅱ動態監測在射頻消融術中的應用雖然外科手術治療是HCC患者能夠獲得長期生存的最有效手段，但是對于多數肝癌晚期患者，已錯過最佳手術時期，近年局部射頻消融術成為HCC非手術治療常用的手段。2017年，Nitta H等人的研究表明射頻消融(Radiofrequency ablation,RFA)治療前陽性腫瘤標志物的數量可預測預后[19]。其研究中采用在RFA治療前2周內檢測AFP、AFP-L3和PIVKA-Ⅱ，這些腫瘤標志物的上限分別為20ng/ml、10%和40mAU/ml，超過上限被稱為陽性腫瘤標志物。將納入研究的患者分為陰性組、單陽性、雙陽性和三陽性組，最后隨訪觀察確定是否復發。經統計分析得出3年無復發生存率和總生存期為陰性、單陽性、雙陽性、三陽性組分別為30%、19%、16%、11%(P=0.02)和94%、88%、66%、37%(P<0.001)，多變量分析表明雙陽或三陽組與腫瘤局部復發(HR 5.48，95%CI 2.44～12.33，P<0.001) 和總生存期(HR 4.21,95%CI 1.89～9.37,P<0.001)相關。以上數據表明，在RFA治療前可通過聯合檢測PIVKA-Ⅱ、AFP及AFP-L3評估患者是否適用此治療方式。另外，在HCC患者射頻消融術后，PIVKA-Ⅱ是血管浸潤最有效的預測因子,相比PIVKA-Ⅱ水平≤100mAU/ml，當PIVKA-Ⅱ為101～200mAU/ml時，危險比為1.95；PIVKA-Ⅱ水平>200mAU/ml時，危險比為3.22，較AFP及AFP-L3敏感性高[20]。Lee S等人的一項回顧性研究結果表明，RFA術后PIVKA-Ⅱ是一個獨立的預后因子，采用COX比例風險模型分析結果顯示，患者總生存期和無復發生存率的危險比分別為(HR 3.438，95%CI 1.33～8.877，P=0.011；HR 4.934,95%CI 2.761～8.816，P<0.001)，而AFP只與無復發生存率相關(HR 1.995,95%CI 1.476～2.697，P<0.001)，與總生存期無關[21]。

3 總結與展望

綜上所述，目前的很多研究都指出PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌的診斷、預后監測、預測復發等多方面具有良好的敏感性和特異性，并且在與其他腫瘤標志物AFP、AFP-L3聯合檢測可提高其作用，但是仍需要大量臨床研究以使其可能的臨床價值最大化。另外，目前對PIVKA-Ⅱ在肝細胞癌中合成的機制中證實了PIVKA-Ⅱ是一個致癌因子，在HCC的發展中介導了促進HCC的增殖、侵襲和轉移的信號通路的激活，因此，在未來有可能通過靶向抑制信號通路的方式治療HCC。所有這些研究中，采取的臨界值都沒有統一標準，后續的還需要大量的實驗，希望可以有確切的標準為HCC的早期診斷及預后監測提供更加可靠的依據。