沉默Fis1基因對METH誘導體外培養SH-SY5Y細胞增殖能力、線粒體膜電位和超微結構的影響

黃仕美，牟登峰，王 琪，鄭 丹，齊曉嵐，官志忠，于燕妮，樓迪棟

(1. 貴州醫科大學法醫學院法醫病理學教研室， 貴州 貴陽 550004； 2. 貴陽婦幼保健院圍產期保健科，貴州 貴陽 550004；3. 貴州醫科大學地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室，貴州省醫學分子生物重點實驗室，貴州 貴陽 5500044. 貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550004)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)因毒性較低、起效較快、作用持久，并趨向低齡化，已嚴重危害到公共衛生安全和社會安全。探索METH致神經細胞的神經毒性機制，獲取治療和預防METH神經毒性的方法已迫在眉睫。研究認為，線粒體病理過程與METH致細胞損傷密切相關，包括線粒體氧化還原平衡[1]、線粒體自噬[2]、線粒體鈣管理[3]、線粒體能量合成[4]和線粒體促凋亡因子釋放[5]。線粒體過度分裂產生新的線粒體，新生線粒體膜電位較低、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量低[1,6]，這些受損的線粒體不能產生足夠的ATP來促進細胞新陳代謝，而且釋放出促凋亡因子進入細胞質/細胞核，以啟動線粒體凋亡途徑[7-8]。例如，在內皮氧化損傷中，線粒體分裂損害線粒體DNA轉錄和復制，并因此抑制線粒體呼吸復合物的表達[6]，導致ATP消耗。我們前期研究發現，METH可誘導體外培養人神經母細胞瘤細胞(human neuroblastoma cells，SH-SY5Y cells)增殖能力減弱，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平下降，線粒體超微結構改變，線粒體趨向分裂，啟動線粒體自噬，并發現線粒體融合蛋白1(mitofusin 1，Mfn1)和線粒體分裂蛋白1(fisson 1，Fis1)蛋白表達異常，這些線粒體形態與功能改變可能與Mfn1和Fis1調節的線粒體動力學有關。為進一步探索METH誘導SH-SY5Y細胞毒性損傷與Fis1之間的相互關系，本研究擬通過沉默Fis1基因，下調Fis1蛋白表達后，檢測和觀察METH誘導SH-SY5Y細胞增殖能力、MMP水平和線粒體超微結構，探討Fis1在METH誘導體外培養SH-SY5Y細胞增殖能力、線粒體膜電位和超微結構變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞SH-SY5Y細胞，購于Sigma公司。

1.2 試劑與儀器METH(美國Cerilliant公司，標準品編號：M-009，純度：99.9%)；siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；脂質體LipofectamineTM3000(美國Invitrogen公司)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；胎牛血清(美國BI公司)；兔抗人Fis1單克隆抗體(美國Abmart公司)；兔抗人β-actin抗體(美國Gene Tex公司)。恒溫細胞培養箱、ND2000型超微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)；ELX800UV酶標儀、化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)；DMi8型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)；AllegraX-30R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)。

1.3 細胞培養、轉染及METH處理將體外培養SH-SY5Y細胞凍存管迅速放入37 ℃恒溫水浴箱中，輕輕搖動融化后移入培養瓶中，并加入4 mL的完全培養基(90%高糖DMEM培養基+10%滅活胎牛血清+1%雙抗)，輕柔勻速吹打細胞制成單細胞懸液，放入37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。次日更換培養基，繼續放入恒溫箱中培養。待培養瓶中細胞貼壁長至80%～90%時，將細胞按1×106·mL-1的密度接種于6孔培養板。待細胞貼壁生長至70%～80%進行轉染，轉染實驗按照說明書嚴格操作。分組：未沉默組(0 mmol·L-1METH、1.0 mmol·L-1METH、2.0 mmol·L-1METH)；沉默陰性組(0 mmol·L-1METH+siRNA-NC、1.0 mmol·L-1METH+siRNA-NC、2.0 mmol·L-1METH+siRNA-NC)，siRNA-NC非特異性序列：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGA ATT-3′；沉默組(0 mmol·L-1METH+siRNA-Fis1、1.0 mmol·L-1METH+siRNA-Fis1、2.0 mmol·L-1METH+siRNA-Fis1)，siRNA-Fis1特異性序列：5′- GCUGUGUCCAAGUCCAAAUTT-3′，5′-AUU UG GACUUGGACACAGC TT- 3′。METH誘導未沉默組、沉默陰性組和沉默組24 h，濃度和時間選擇參照文獻[9]和細胞增殖-毒性檢測實驗(CCK-8)結果。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖將siRNA-Fis1和siRNA-NC分別轉染后的細胞消化、吹打成單細胞懸液，按1×104個/孔接種于96孔培養板中，放入37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。待細胞貼壁長至60%～70%時，換含有METH(0、1.0、2.0 mmol·L-1)的培養液培養，未沉默組、沉默陰性組和沉默組的每個濃度做6個復孔，METH誘導24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將96孔板放入37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育3 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD)值，并計算細胞存活率。細胞存活率/%=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5 Western blot法檢測Fis1蛋白表達水平使用RIPA裂解細胞提取總蛋白，超微量紫外分光光度計檢測各樣本蛋白濃度。經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V)、轉膜(100 V，45 min。)、室溫封閉2 h后，一抗Fis1(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h。將PVDF膜與超敏發光液(ECL)試劑反應1 min后，使用化學發光成像系統掃描PVDF膜，ImageJ軟件分析Fis1蛋白條帶，使用β-actin蛋白條帶校正。

1.6 MMP檢測采用JC-1法，按照試劑盒說明書操作。使用倒置熒光顯微鏡觀察METH誘導SH-SY5Y細胞24 h后的各組細胞的紅、綠熒光，計算機采集熒光圖像，使用ImageJ軟件重疊紅綠熒光，將合成熒光的光密度比值作為膜電位表達水平值。

1.7 透射電鏡觀察體外培養SH-SY5Y細胞線粒體超微結構收集細胞；將細胞固定于2.5% 戊二醛溶液中4 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；1%鋨酸溶液后固定2 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；丙酮脫水；Epon812樹脂包埋；切片；醋酸鈾、硝酸鉛染色；在H-7650型透射電鏡下，根據觀察內容不一選擇不同的放大倍數進行超微結構觀察和拍照；每個樣本隨機拍片9張，同時避免同一細胞重復拍照。將類圓形(短軸/長軸≥0.7)線粒體定義為小球狀線粒體，短軸/長軸<0.7的線粒體定義為棒狀線粒體，并排除因為圖片質量模糊等原因不能明確定義形態的線粒體。計數每組樣本中棒狀線粒體數和小球狀線粒體數，小球狀線粒體數與棒狀線粒體數比值代表線粒體分裂水平。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測結果如Fig 1所示，使用METH(0、1.0、2.0 mmol·L-1)誘導體外培養SH-SY5Y細胞24 h后，SH-SY5Y細胞存活率隨METH濃度的增加而減小(P<0.05)，METH抑制SH-SY5Y細胞增殖。且在2.0 mmol·L-1METH誘導下，沉默組細胞存活率明顯高于未沉默組和沉默陰性組(P<0.05)。

2.2 沉默Fis1基因對Fis1蛋白表達的影響如Fig 2所示，未沉默組、沉默陰性組和沉默組中，各組組內與對照組(0 mmol·L-1METH)比較， 1.0和2.0 mmol·L-1METH誘導SH-SY5Y細胞，Fis1蛋白表達水平分別升高31%、47%，32%、45%，22%、51%(P<0.05)；與未沉默組相同濃度比較，沉默組Fis1蛋白表達水平分別降低27%、32.5%、25%(P<0.05)；與沉默陰性組相同濃度比較，沉默組Fis1蛋白表達水平分別降低31%、36%、28%(P<0.05)。

Fig 1 Effect of METH on survival rate of SH-SY5Y cells cultured in vitro

2.3 SH-SY5Y細胞MMP水平如Tab 1、Fig 3所示，未沉默組、沉默陰性組和沉默組中，各組組內與對照組(0 mmol·L-1METH)比較， 1.0和2.0 mmol·L-1METH誘導SH-SY5Y細胞，MMP水平降低(P<0.05)，熒光顯微鏡下，隨METH濃度增加，SH-SY5Y細胞紅色熒光減弱，綠色熒光增強；與未沉默組和沉默陰性組相同濃度比較，沉默組MMP水平升高(P<0.05)，紅色熒光增強。

Tab 1 MMP red-green overlapping fluorescence ratio of SH-SY5Y cells cultured in vitro between control groups and METH treatment groups n=3)

*P<0.05vscontrol

2.4 METH對SH-SY5Y細胞線粒體超微結構的影響如Tab 2、Fig 4所示，與對照組(0 mmol·L-1METH)比較，未沉默組、沉默陰性組和沉默組在2.0 mmol·L-1METH誘導24h后，透射電鏡觀察見各組線粒體小球狀結構增加，線粒體分裂水平明顯增高(P<0.01)；與未沉默組和沉默陰性組比較，沉默組線粒體分裂水平差異無顯著性(P>0.01)。未沉默組和沉默陰性組中部分線粒體呈現出空泡化，損傷嚴重，同時在沉默陰性組中發現自噬溶酶體，沉默組中個別棒狀結構的線粒體內外膜完整，線粒體嵴清晰可見。

Tab 2 Comparison of ratio of small globular mitochondria to rod-like mitochondria in SH-SY5Y cells cultured in vitro for 24 h (n=9)

**P< 0.01vscontrol

3 討論

METH俗稱“冰毒”，具有極強的精神興奮和致幻作用，METH長期濫用已嚴重危害社會安全，探明METH的神經毒性機制可為預防和治療METH的神經毒性作用探尋高效、便捷的靶點。Parameyong等[9]研究認為，METH通過誘導線粒體分裂途徑，引起SH-SY5Y細胞線粒體動力學紊亂，參與線粒體碎裂成小球狀結構。此外，MMP的下降是線粒體膜損傷和細胞凋亡的早期指標，此過程與線粒體不斷的分裂有關[10]。線粒體分裂過度或融合不足都會導致線粒體碎裂，降低呼吸作用和能量生產，增加神經元損傷和細胞凋亡的可能性[11]。Fis1的過度表達可以導致線粒體分裂，造成線粒體功能障礙，導致細胞凋亡，藥物抑制分裂可以減輕細胞凋亡[12]。我們前期實驗也發現[13]，METH可誘導體外培養SH-SY5Y細胞增殖能力減弱，MMP水平下降，線粒體超微結構改變，線粒體趨向分裂，啟動線粒體自噬，并發現Mfn1和Fis1蛋白表達異常，這些線粒體形態與功能改變可能與Mfn1和Fis1調節的線粒體動力學有關。為了進一步研究Fis1在METH誘導SH-SY5Y細胞損傷中的重要作用，本實驗通過基因干擾法，沉默Fis1基因，探討Fis1在METH誘導SH-SY5Y細胞損傷中的作用。

Fig 2 Expression of Fis1 protein in SH-SY5Y cells n=3))*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs silent negative group

Fig 3 MMP in SH-SY5Y cells cultured in vitro detected by red-green overlapping fluorescence (×400) Green arrows indicate the normal MMP, while red arrows indicate the decreased MMP.

Fig 4 Observation of mitochondrial ultrastructure of SH-SY5Y cells by TEM (scale bar= 5 μm)

A: Control groups, mitochondria elliptical rod-like structure, normal and clear; B: Unsilent groups: mitochondrial globular structure increased significantly (arrow); C: Silent negative groups: mitochondrial globular structure increased significantly (arrow); D: Silent groups, mitochondrial globular structure decreased, rod structure increased (arrow). M: mitochondria; N: nuclei.

實驗發現，CCK-8實驗中，未沉默組、沉默陰性組和沉默組隨著METH濃度增加，細胞存活率均減小(P<0.05)，表明METH對體外培養SH-SY5Y細胞具有毒性作用；且未沉默組和沉默陰性組細胞存活率減小趨勢相近，表明沉默試劑對細胞無毒性作用或毒性作用微小，不足以降低細胞存活率，排除沉默試劑對細胞毒性的干擾；同時發現，2.0mmol·L-1METH誘導SH-SY5Y細胞24 h后，與未沉默組和沉默陰性組比較，沉默組對應細胞存活率明顯提高(P<0.05)，表明沉默Fis1基因可以減輕細胞損傷，提高細胞增殖能力。進一步研究發現，體外培養SH-SY5Y細胞經METH誘導24h后，未沉默組、沉默陰性組和沉默組組內的MMP水平隨METH的濃度增高呈現降低趨勢(P<0.05)，但與未沉默組和沉默陰性組相同濃度相比，沉默組MMP水平呈現上升趨勢(P<0.05)，MMP得以恢復或接近正常水平，表明沉默Fis1基因對穩定MMP水平起到重要作用。透射電鏡下觀察見對照組線粒體多呈現棒狀結構，線粒體內外膜結構良好，線粒體嵴清晰、正常；未沉默組和沉默陰性組線粒體多為小球狀結構，部分空泡化，并再次觀察到自噬現象，和前期實驗現象基本一致[13]；沉默組中個別棒狀結構的線粒體內外膜保持良好，線粒體嵴清晰可見，雖然與未沉默組和沉默陰性組比較，統計球狀小泡結構/棒狀結構(A/B)無明顯統計學意義，但A/B值下降仍很明顯；這也部分表明沉默Fis1基因可以抑制Fis1蛋白表達，從而可能減弱線粒體過度分裂，線粒體損傷程度得以減輕。沉默Fis1基因，Fis1蛋白表達水平下調，透射電鏡下觀察線粒體超微結構部分改善，MMP水平上升，細胞增殖能力增強。我們推測，沉默Fis1基因抑制Fis1蛋白表達后，線粒體分裂功能下降，穩定線粒體膜結構，提高MMP水平，降低METH對體外培養SH-SY5Y細胞的神經毒性作用，可恢復細胞增殖功能。

綜上所述，沉默Fis1基因，可下調Fis1蛋白表達，可降低線粒體分裂水平和線粒體膜損傷，部分恢復SH-SY5Y細胞增殖能力。線粒體功能紊亂可能是METH誘導體外培養SH-SY5Y細胞神經毒性的重要機制之一，Fis1可能在METH誘導體外培養SH-SY5Y細胞線粒體形態與功能紊亂中起關鍵作用。