異氟醚對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠血管生成及Smad信號(hào)通路的影響

彭 莉，王 勝，殷姜文，葛明月，張貴星，徐 鋒，張慶桐

(1. 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 開(kāi)封 475000; 2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230001；3. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，新疆 石河子 832000)

目前，中國(guó)中風(fēng)患者人數(shù)為7 000萬(wàn)，對(duì)國(guó)民健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，且大多數(shù)幸存者伴有不同程度的殘疾，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前阿替普酶仍然是全球唯一公認(rèn)的最有效的溶栓治療藥物，但因其時(shí)間窗較窄，國(guó)內(nèi)卒中溶栓率不到1.5%[1]，迫切需要研究用于臨床卒中治療的藥物。

異氟醚是臨床常用的吸入麻醉藥，大量研究表明，吸入麻醉劑可以產(chǎn)生腦保護(hù)作用。目前，大多數(shù)研究對(duì)象是異氟醚和七氟醚，對(duì)異氟醚的研究更為廣泛[2-3]。研究表明，異氟醚可增加血管生成標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)增殖和血管生成[4]。我們之前的研究表明，1.5%的異氟醚后處理具有明顯的腦保護(hù)作用[5]。盡管異氟醚的腦保護(hù)作用已被大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，但其具體機(jī)制尚不清楚。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為異氟醚可通過(guò)降低腦代謝率發(fā)揮保護(hù)作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腦保護(hù)的確切機(jī)制非常復(fù)雜，降低腦代謝率可能是其中一個(gè)原因，但機(jī)體相關(guān)信號(hào)通路中的許多生物因子可能參與了該保護(hù)過(guò)程。

Smad蛋白家族是在脊椎動(dòng)物、昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子家族，Smads信號(hào)分子是信號(hào)通路中的重要家族。Smad蛋白有8個(gè)成員，其中Smad3是脊椎動(dòng)物TGF-β和活化素受體的底物，是目前公認(rèn)的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵下游介質(zhì)。近期研究表明，通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路可恢復(fù)大鼠下肢缺血/再灌注損傷中的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[6]。此外，TGF-β通過(guò)Smad2/3-VEGF/TNF-α信號(hào)通路，參與脈絡(luò)膜新生血管形成[7]。因此，我們推測(cè)，Smad信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成起到腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過(guò)線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，缺血90 min，再灌注的即刻給予1.5%的異氟醚持續(xù)吸入60 min，模擬臨床上腦卒中病人的手術(shù)麻醉過(guò)程，旨在闡明Smad通路在腦卒中后腦缺血/再灌注損傷中的作用，以及異氟醚的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，以期為臨床卒中治療提供新的依據(jù)和思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)♂SD大鼠，體質(zhì)量(220～280) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK(京) 2012-0001)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分已經(jīng)通過(guò)石河子大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑異氟醚(美國(guó)雅培制藥有限公司)；SIS3 HCl抑制劑(美國(guó)Selleck公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美國(guó)Sigma公司)；Smad3、CD34抗體(美國(guó)Santa Cruz)；p-Smad3抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology)；VEGF抗體(Abcam公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TUNEL試劑盒(德國(guó) Roche公司)。

1.3 儀器麻醉氣體檢測(cè)儀(美國(guó)Datex Ohmeda)；激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Olympus)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立、分組及給藥將動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：假手術(shù)組(Sham組)、缺血/再灌注組(I/R組)、異氟醚后處理組(ISO組)和Smad3抑制劑組(ISO+SIS3組)，每組10只。Sham組游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，不進(jìn)行栓塞。I/R組結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈上剪一小口，插入4-0線栓約18 mm以阻斷大腦中動(dòng)脈的血流，90 min后拔出線栓進(jìn)行再灌注。ISO組先建立大腦中動(dòng)脈栓塞模型，90 min栓塞后開(kāi)始再灌注，再灌注的即刻吸入1.5%異氟醚60 min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持大鼠體溫在37 ℃左右。ISO+SIS3組在大鼠腦缺血前30 min腹腔注射SIS3 HCl 2.5 mg·kg-1，其余操作同ISO組。Sham組、I/R組和ISO組于缺血前30 min給予等量的DMSO。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分按照Z(yǔ)ea-Longa法評(píng)估腦缺血對(duì)神經(jīng)功能的影響。0分為無(wú)神經(jīng)功能缺陷；1分為輕微神經(jīng)功能缺陷，無(wú)法完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為中度神經(jīng)功能缺陷，表現(xiàn)為向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分為嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷，表現(xiàn)為向?qū)?cè)傾倒；4分為無(wú)法獨(dú)立行走，意識(shí)水平低下。1～3分為成功模型，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 TTC染色大鼠再灌注24 h后，深度麻醉處死，然后用咬骨鉗打開(kāi)顱骨，并完整取腦。用4 ℃生理鹽水沖洗腦組織周?chē)难海缓髮⒛X置于-20 ℃的冰箱中30 min。將大鼠大腦冠狀切成2 mm厚腦片，然后進(jìn)行TTC染色。將新鮮腦組織切片與2% TTC染色溶液于37 ℃避光染色30 min，每5 min翻動(dòng)腦組織并觀察染色情況。染色后，將腦移入4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，拍照并分析梗死體積。使用Image-Pro Plus 6.0和SPSS 17.0進(jìn)行梗死體積百分比的統(tǒng)計(jì)分析，并用GraphPad Prim 6.0繪圖。

2.4 HE染色大腦中動(dòng)脈栓塞24 h后，將大鼠麻醉后，用300 mL生理鹽水經(jīng)心臟灌注，然后用300 mL 4%多聚甲醛溶液灌注。取出腦，并在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明和石蠟包埋。用切片機(jī)連續(xù)4 μm厚的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇脫水后，將石蠟切片用蘇木精染色3 min，伊紅染色1 min。染色后，用蒸餾水沖洗切片，脫蠟脫水后用中性樹(shù)膠封片。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬CA1區(qū)的腦損傷情況。

2.5 尼氏染色常規(guī)脫蠟脫水，然后將切片用硫堇在37 ℃下染色1 h。分化液分化4～8 s，直至消除大部分染色。雙蒸水沖洗染料后，分別在70%、80%、95%、100%乙醇中脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。最后在顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬CA1區(qū)的細(xì)胞形態(tài)，以評(píng)估腦損傷。

2.6 TUNEL分析石蠟切片置于60 ℃的烘箱中烤片2 h。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL測(cè)定。將石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，然后用PBS沖洗切片3次5 min。在室溫下用含有0.3% Triton X-100的PBS處理30 min后，用3% H2O2孵育20 min。37 ℃下將腦組織在黑暗中浸于反應(yīng)液中染色1 h，然后在37 ℃下浸入POD轉(zhuǎn)化溶液中30 min，最后DAB顯色。在顯微鏡下，計(jì)數(shù)缺血腦中的棕色TUNEL陽(yáng)性和藍(lán)色正常神經(jīng)元的數(shù)目。細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index， AI)是100個(gè)細(xì)胞核中凋亡細(xì)胞核的數(shù)量：AI/%=(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2.7 免疫熒光染色將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，并在標(biāo)準(zhǔn)組織化學(xué)程序后微波修復(fù)20 min。然后，將切片用3% H2O2孵育20 min。用含有0.3% Triton X-100和10%牛血清白蛋白的PBS封閉后，將切片與1 ∶100抗VEGF和1 ∶100抗-CD34在4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗后，與FITC標(biāo)記的二抗在37 ℃下溫育1 h，然后碘化丙錠溶液中避光染核5 min。最后，使用共聚焦激光掃描顯微鏡獲取圖像，并通過(guò)Image-Pro Plus 6.0測(cè)量平均熒光強(qiáng)度(mean density，MD)，GraphPad Prim 6.0繪制免疫熒光半定量統(tǒng)計(jì)圖。

2.8 Western blot使用RIPA裂解物、PMSF和磷酸酶抑制劑從缺血腦組織中提取蛋白。RIPA裂解物、PMSF和磷酸酶抑制劑以100 ∶1 ∶1的比例制備混合物，將1 μg組織與10 μL混合物混合，然后用剪刀在冰上切割組織。將組織勻漿以12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。棄沉淀物，取上清液作為總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白上樣到SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，將膜分別與抗體Smad3、p-Smad3、VEGF、CD34和β-actin在4 ℃孵育過(guò)夜。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，并用Image J進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 異氟醚對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響如Fig 1所示，與Sham組比較，I/R組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分升高(P<0.05);與I/R組比較，ISO組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+SIS3組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.05)。

Fig 1 Neurological function scores with

*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R;▲P<0.05vsISO.

3.2 異氟醚對(duì)MCAO大鼠腦梗死面積的影響如Fig 2所示，2% TTC溶液染色后，Sham組無(wú)梗死；I/R組缺血側(cè)可見(jiàn)明顯白色梗死灶；與I/R組比較，ISO組大鼠腦梗死面積減少(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+SIS3組大鼠腦梗死面積明顯增加(P<0.05)。

3.3 異氟醚對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織病理學(xué)的影響Fig 3A、3B的HE染色結(jié)果顯示，海馬CA1神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化與皮質(zhì)神經(jīng)元相似。Sham組細(xì)胞形態(tài)正常，邊界清晰；缺血/再灌注組中，細(xì)胞核明顯固縮，呈現(xiàn)不規(guī)則外觀；與缺血/再灌注組相比，ISO組神經(jīng)元核固縮減少；在ISO+ SIS3組中，大量不規(guī)則和空泡細(xì)胞，細(xì)胞周?chē)g隙變寬。尼氏染色顯示(Fig 3C、3D)，Sham組神經(jīng)元呈藍(lán)紫色，染色深，神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體豐富；缺血/再灌注組細(xì)胞明顯減少、染色淺、結(jié)構(gòu)模糊、尼氏小體減少；ISO組中的神經(jīng)元數(shù)量明顯高于缺血/再灌注組，尼氏小體增多；與ISO組相比，ISO+ SIS3組中的細(xì)胞染色淺，尼氏小體數(shù)量明顯減少。

Fig 2 Cerebral infarct volumes in rats reduced by isofluranepost-conditioning

3.4 異氟醚對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織細(xì)胞凋亡的影響如Fig 4所示，在Sham組中，僅有少量TUNE陽(yáng)性細(xì)胞；與缺血/再灌注組相比，異氟醚后處理降低了缺血側(cè)腦組織中的凋亡細(xì)胞(P<0.05)；Smad3抑制劑明顯增加了缺血側(cè)腦組織的凋亡細(xì)胞(P<0.05)。

3.5 異氟醚對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織VEGF和CD34蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，在免疫熒光染色中，再灌注24 h后，缺血/再灌注損傷明顯增強(qiáng)缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)VEGF和CD34的表達(dá)水平；1.5%異氟醚進(jìn)一步增強(qiáng)了VEGF和CD34的表達(dá)水平；而Smad3抑制劑明顯降低了VEGF和CD34的表達(dá)。

Fig 3 Morphological evaluation of HE staining and Nissl staining in hippocampal CA1 and cortex after I/R injury(scale bar=100 μm)

A: Cell morphology by HE staining in the cortex; B: Cell morphology by HE staining in the hippocampal CA1; C: Nissl staining of the surviving cells in the cortex; D: Nissl staining of the surviving cells in the hippocampal CA1.

Fig 4 TUNEL staining in cerebral cortex (A) and hippocampus (B) after I/R injury in n=5)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R;▲P<0.05vsISO.

3.6 異氟醚對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織p-Smad3、Smad3、VEGF和CD34蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，各組Smad蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Sham組比較，I/R組p-Smad3、VEGF和CD34蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與I/R組比較，ISO組p-Smad3、VEGF和CD34蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)；與ISO組相比，ISO+SIS3組p-Smad3、VEGF和CD34蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

4 討論

中風(fēng)是一種腦血管疾病，可分為血管栓塞引起的缺血性中風(fēng)和血管破裂引起的出血性中風(fēng)，前者較常見(jiàn)，約占80%[8]。腦卒中一段時(shí)間后，血流再通常會(huì)加重腦損傷和腦功能障礙，這種現(xiàn)象稱(chēng)為腦缺血/再灌注損傷。其病理生理機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥、興奮性毒性、凋亡途徑的激活和鈣超載等。這些因素相互作用導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能障礙，因此，研究具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物具有重要的臨床價(jià)值和意義。

Fig 5 Expression of VEGF and CD34 in ischemic brain of n=5)

A: IF of VEGF and MD analysis of VEGF in the cerebral cortex. The arrows (white) indicated VEGF protein expression; B: IF of VEGF and MD analysis of VEGF in the hippocampal CA1. The arrows (white) indicated VEGF protein expression; C: IF of CD34 and MD analysis of CD34 in the cerebral cortex. The arrows (white) indicated CD34 protein expression; D: IF of CD34 and MD analysis of CD34 in the hippocampal CA1. The arrows (white) indicated CD34 protein expression.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R;▲P<0.05vsISO.

Fig 6 Protein expression levels and Western blot analysis of p-Smad3, Smad3, VEGF and n=5)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R;▲P<0.05vsISO

本研究表明，Smad3信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)VEGF和CD34的表達(dá)，介導(dǎo)中風(fēng)后異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)首先觀察大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)的變化，由于海馬CA1區(qū)域的錐體神經(jīng)元易受缺血/再灌注損傷，且海馬錐體神經(jīng)元在缺血性腦損傷后可以再生[9]，我們對(duì)海馬CA1區(qū)也進(jìn)行了觀察。本研究表明，異氟醚后處理可以明顯降低腦梗死體積和神經(jīng)功能評(píng)分，增加存活神經(jīng)元，減少大鼠腦缺血/再灌注損傷后的凋亡細(xì)胞。

異氟醚在腦卒中MCAO模型缺血的急性期具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究的數(shù)據(jù)與Gaidhani等[10]最近的一項(xiàng)研究一致，后者證明90 min異氟醚麻醉幾乎完全保護(hù)腦組織免受(transient MCAO)tMCAO誘導(dǎo)的損傷。此外，Jeong等[11]報(bào)道，異氟醚對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。研究還發(fā)現(xiàn)，乳化異氟醚后處理改善了動(dòng)物全腦缺血/再灌注損傷模型中大鼠心臟驟停模型的存活率和神經(jīng)功能[12]。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本研究證明了異氟醚在改善缺血性損傷方面的保護(hù)作用。

本研究表明，Smad3特異性抑制劑SIS3 HCl可以抑制異氟醚的神經(jīng)保護(hù)作用。我們進(jìn)一步研究了大鼠缺血/再灌注損傷后，MCAO模型中異氟醚的神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)，在蛋白質(zhì)水平證明異氟醚后處理后p-Smad3上調(diào)。表明缺血/再灌注損傷后，異氟醚誘導(dǎo)的Smad3信號(hào)通路的激活。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SIS3 HCl的應(yīng)用降低了p-Smad3的表達(dá)水平，然而，總Smad3的含量沒(méi)有明顯差異。總之，當(dāng)體內(nèi)Smad3信號(hào)傳導(dǎo)途徑被SIS3 HCL抑制時(shí)，異氟醚的腦保護(hù)作用減弱。因此，本研究表明，異氟醚的神經(jīng)保護(hù)作用與Smad3信號(hào)途徑相關(guān)。海馬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，Smad途徑介導(dǎo)TGF-β調(diào)節(jié)的海馬顆粒神經(jīng)元的增殖和分化[13]。辛二酰苯胺異羥肟酸預(yù)處理通過(guò)抑制Smad信號(hào)，有效抑制TGF-β驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖、分化和血管生成細(xì)胞因子的表達(dá)[14]。因此，先前的研究和本研究都表明，激活的Smad3信號(hào)通路對(duì)介導(dǎo)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)至關(guān)重要。

VEGF促進(jìn)血管生成以改善缺血/再灌注損傷后的神經(jīng)功能和神經(jīng)血管重塑。CD34被認(rèn)為是血管生成的間接標(biāo)志物。本研究免疫熒光和Western blot分析表明，異氟醚后處理明顯增加缺血側(cè)腦組織VEGF和CD34的表達(dá)水平。本研究的結(jié)果與最近的研究結(jié)果一致，缺血性損傷增加細(xì)胞培養(yǎng)物中VEGF的表達(dá)水平，促進(jìn)缺血性中風(fēng)的血管生成[15]。有研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可提高VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)，從而減輕大鼠腦缺血性損傷[16]。此外，hyperforin治療可明顯增加缺血半球VEGF和CD34的表達(dá)，對(duì)急性缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。總之，本研究表明異氟醚增強(qiáng)了VEGF和CD34的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，并減弱大鼠腦缺血/再灌注損傷。

最后，我們進(jìn)一步確定Smad3信號(hào)通路是否參與了異氟醚誘導(dǎo)的血管生成。給予抑制劑SIS3 HCL后，通過(guò)免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定VEGF和CD34的表達(dá)水平。結(jié)果表明，給予SIS3 HCL后，缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)的VEGF和CD34的表達(dá)水平明顯下調(diào)，同時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高，腦梗死體積增加，凋亡神經(jīng)元增多。提示Smad3信號(hào)通路介導(dǎo)異氟醚的保護(hù)作用，并且與大鼠腦缺血/再灌注損傷后VEGF和CD34的表達(dá)有關(guān)。

血管生成是腦卒中后功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素。目前，中風(fēng)病理生理學(xué)研究的重點(diǎn)已從單純血管概念轉(zhuǎn)向神經(jīng)血管單元，神經(jīng)血管單元被認(rèn)為在卒中恢復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。我們接下來(lái)將對(duì)神經(jīng)血管單元進(jìn)行更全面的研究，例如中風(fēng)后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)血管單元細(xì)胞之間的串?dāng)_，進(jìn)一步探索異氟醚的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。總之，我們發(fā)現(xiàn)異氟醚通過(guò)Smad3信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注損傷后VEGF和CD34的表達(dá)。異氟醚在減輕中風(fēng)和腦缺血方面的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)完成于新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，感謝各位老師和同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)及幫助。)