二甲雙胍通過自噬緩解氨誘導的星形膠質細胞老化

楊 丹，賈桂枝，戴紅良

(錦州醫科大學 1. 附屬第一醫院婦產科與計劃生育門診、2. 生理學教研室，遼寧 錦州 121001)

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是由肝衰竭導致的神經紊亂。根據肝臟疾病的不同類型，HE可分為三種類型：急性肝衰竭可引起A型HE；單純門體旁路(無肝臟疾病)可引起B型HE；肝硬化可引起C型HE[1]。絕大多數的肝硬化患者在其病程中都會出現不同程度的HE。HE患者普遍存在隱匿性或顯性的精神心理異常和認知功能損害，嚴重影響患者的生活質量。

目前學界就肝性腦病的發病機制提出了多種假說，其中最為重要的是“氨中毒學說”。該學說認為嚴重肝病導致機體對氨的清除不力，導致血氨升高，增高的血氨通過血腦屏障進入腦組織，干擾腦細胞，尤其是星形膠質細胞的功能和代謝，導致腦功能障礙的出現。最近研究顯示，氨刺激可導致星形膠質細胞發生老化性改變，這可能是引起患者持續認知損害的病理基礎[2]。

二甲雙胍是目前廣泛使用的一種2型糖尿病降糖藥物。但在其降糖效應之外，近年來越來越的研究顯示二甲雙胍還可對老化相關狀態和老化疾病起到保護作用。這些保護作用可體現在生理功能(如活動度、肌肉強度與耐力)、臨床預后(如血壓、體重和心血管健康)和心理預后(如認知、抑郁和生活質量)等多個方面[3]。二甲雙胍可通過調控炎癥、自噬、細胞老化等多種機制發揮其對老化性疾病的保護作用[4]。目前，對于二甲雙胍是否能對氨誘導的星形膠質細胞老化起到保護作用并不清楚。因此，本研究旨在就此問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養基、馬血清購自美國Gibco公司；二甲雙胍、雙丁酰環磷腺苷(dibutyryl cyclic AMP，dBcAMP)、Bafilomycin購自Sigma公司；BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；微管相關蛋白輕鏈I/II(microtube-associated protein 1 light chain Ⅱ， LC3BⅠ/Ⅱ)、p62、Beclin1、p16一抗均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 儀器CO2培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)、電泳儀及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；多功能酶標儀(美國Bio Tek公司)。

1.3 細胞培養取24 h內出生CD-1小鼠乳鼠大腦半球新皮層，經渦旋震蕩及尼龍網濾過后接種于60 mm的Falcon Primaria培養皿、24孔培養板或35 mm的共聚焦培養皿中。培養基先是含15%胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM，10天后，將血清更換為10%的馬血清。每3～4 d換液，細胞生長兩周后，加入0.25 mmol·L-1的dBcAMP以促細胞分化。生長25～28 d的細胞用于后續實驗。

1.4 實驗分組待體外培養星形膠質細胞分化成熟后將細胞分為4組：對照組、氯化銨組、二甲雙胍(250、500 μmol·L-1)組，檢測二甲雙胍對細胞自噬和老化的影響。細胞先以二甲雙胍預處理30 min，隨后加入3 mmol·L-1氯化銨共同作用72 h。

1.5 細胞DNA合成檢測利用BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒檢測DNA合成來間接反映細胞的增殖情況。用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)溶液標記細胞后，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，再用TritonX-100(0.3%)室溫通透15 min，最后加入Click反應液室溫避光反應30 min。充分洗滌后，用多功能酶標儀檢測細胞熒光強度。檢測參數為，激發波長：495 nm，發射波長：519 nm。

1.6 Western blot實驗細胞加入RIPA裂解液(臨用前加入1% PMSF)提取總蛋白，BCA法測蛋白后，取50 g蛋白行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉儀至PVDF膜。隨后，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入LC3、p62、Beclin1、p62一抗4℃孵育過夜。于次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2小時，增強化學發光顯色。

2 結果

2.1 氨對星形膠質細胞自噬標志蛋白表達的影響Fig 1A結果顯示，與對照組相比，3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯上調星形膠質細胞LC3Ⅱ、Beclin1、p62的表達。Fig 1B結果顯示，在bafilomycin存在的情況下，氨誘導的LC3Ⅱ表達發生了進一步的上調。表明氯化銨對星形膠質細胞具有啟動自噬和阻斷自噬流的雙重作用。

2.2 自噬抑制對氨致星形膠質細胞增殖抑制的影響Fig 2結果顯示，與對照組相比，3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯抑制星形膠質細胞增殖，3-甲基腺苷(3-methyladenine, 3-MA)預處理進一步增強了氨對星形膠質細胞的抑制作用。提示自噬啟動對于氨誘導的星形膠質細胞的增殖抑制具有保護作用。

2.3 自噬抑制對氨致星形膠質細胞老化的影響Fig 3結果顯示，3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯上調星形膠質細胞老化標志物p16的表達，3-MA預處理進一步增加了氨誘導的星形膠質細胞p16的表達。提示自噬啟動對于氨誘導的星形膠質細胞的老化具有保護作用。

2.4 二甲雙胍對氨誘導星形膠質細胞LC3Ⅱ和p62表達的影響Fig 4結果顯示，與對照組相比，3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯上調星形膠質細胞LC3BⅡ的表達，二甲雙胍預處理進一步增加了LC3BⅡ的表達；3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯上調星形膠質細胞p62的表達，二甲雙胍預處理則明顯降低了氨誘導的p62表達。表明二甲雙胍可強化氨對星形膠質細胞自噬誘導效應。

Fig 1 Effect of ammonia on expression of autophagic markers in astrocytes n=3)

A： Effect of ammonia on expression of autophagic markers Beclin1, LC3BⅠ/Ⅱ and p62；B： Effect of bafilomycin on ammonia-induced upregulation of LC3BⅠ/Ⅱ expression.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

2.5 二甲雙胍對氨致星形膠質細胞增殖抑制的影響Fig 5結果顯示，與對照組相比，3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯抑制氨誘導的星形膠質細胞增殖，二甲雙胍預處理明顯緩解氨誘導的星形膠質細胞增殖抑制。表明二甲雙胍可緩解氨導致的星形膠質細胞增殖抑制。

Fig 2 Effect of 3-MA on ammonia-induced proliferation inhibition of astrocytes n=5)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group

Fig 3 Effect of 3-MA on ammonia-induced up-regulation of senescence marker p16 in astrocytes n=3)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

2.6 二甲雙胍對氨誘導星形膠質細胞老化標志物p16表達的影響Fig 6結果顯示，與對照組相比，3 mmol·L-1氯化銨刺激72 h可明顯上調星形膠質細胞老化標志物p16的表達，二甲雙胍預處理明顯緩解氨誘導的星形膠質細胞p16的表達。表明二甲雙胍可緩解氨導致的星形膠質細胞老化。

3 討論

自噬是細胞維持其內穩態一種高度保守的重要生物學過程，當細胞遭受到營養剝奪等各種應激時，其可通過自噬降解長壽命蛋白和細胞器，引起胞質成分的大量降解和循環利用，從而為細胞提供必要的營養物質[5]。之前研究證實在不同的細胞，氨可對細胞自噬過程起到促進和/或抑制作用[6-8]，但目前尚不清楚氨如何影響星形膠質細胞的自噬過程。

Fig 4 Effect of metformin on ammonia-induced up-regulation of LC3BⅡ and p62 in astrocytes n=3)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

Fig 5 Effect of metformin on ammonia-induced proliferation inhibition of astrocytes n=5)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

常用的自噬標志蛋白有LC3、p62和Beclin1等。當自噬啟動時，LC3BII表達水平上調，p62則隨著自噬溶酶體的降解而減少[6]。Beclin1對于自噬的啟動至關重要[9]；而當自噬流發生阻斷時，則會出現LC3BII和p62表達水平的同時上調。在本研究中，氨刺激可增加LC3BII和p62的表達，同時Beclin1的表達也明顯增加。而且，bafilomycin預處理的情況下，氨可進一步促進LC3BII表達的上調。上述結果表明氨刺激對星形膠質細胞細胞自噬的調控呈現出雙重作用：一方面可促進自噬的啟動，而另一方面，其又可阻斷細胞自噬流。

Fig 6 Effect of metformin on ammonia-induced up-regulation of senescence marker p16 in astrocytes n=3)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

自噬的發生與腦缺血、帕金森氏病、多發性硬化等多種中樞神經系統功能紊亂密切相關。誘導自噬發生可緩解炎癥的發生，并對神經退行性疾病起到保護作用[10]。值得注意的是，自噬對機體并不總是起著保護性的作用，過度的自噬可能會破壞胞質和細胞器，釋放出凋亡相關因子，導致細胞的死亡。因此，自噬對細胞來說是一把雙刃劍[11]。在本研究中，自噬抑制劑3-MA可使氨刺激誘導的星形膠質細胞老化標志物p16蛋白的表達進一步增加，提示自噬活動的增強有利于緩解氨對星型膠質細胞老化的毒性作用。

二甲雙胍是目前臨床上使用的2型糖尿病一線治療藥物。最近研究顯示，二甲雙胍還可通過其非降糖作用發揮其生物學保護效應[12]。二甲雙胍可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、自噬調控等途徑對中樞神經系統產生有益影響。已有研究顯示二甲雙胍可通過促自噬活性調控老化過程，延長壽命，改善老年個體心血管功能[13]。Chen等[14]最近研究也證實,二甲雙胍可通過其促自噬活性抗髓核細胞的凋亡和老化，緩解腰椎間盤退變。同時，二甲雙胍明顯改善大腦的老化狀態的機制也與其促自噬活性有關[15]。基于以上研究，我們推測二甲雙胍亦有可能對氨誘導的星形膠質細胞老化起到保護作用。在本研究中，二甲雙胍預處理可明顯促進氨誘導的LC3BII的進一步上調，并降低p62的水平，提示二甲雙胍可促進氨毒性狀態下星形膠質細胞的自噬；同時，二甲雙胍預處理明顯降低老化標志物p16的表達。說明二甲雙胍對氨誘導的星形膠質細胞老化確實起到了保護作用，其機制可能與其促自噬活性有關。

綜上所述，天然產物衍生物二甲雙胍可通過增強星形膠質細胞自噬的過程，緩解氨對抗星形膠質細胞老化的毒性作用。

(致謝：本課題在遼寧省腦與脊髓損傷重點實驗室完成，特別感謝實驗室的指導老師及各位參與者！)