伐尼克蘭通過PKR/STAT3通路調節自噬功能改善術后認知功能障礙

朱守峰，黃春霞， 胡憲文

(麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室，安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科，安徽 合肥 230601)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年患者術后常見的一種中樞神經系統并發癥，主要表現為精神錯亂、焦慮、人格改變和記憶受損，可導致患者術后致殘率和死亡率的增加，以及社會經濟負擔的增加[1]。在接受心臟手術的老年患者中，POCD的發生率為20%～79%，在接受非心臟手術的老年患者中是4.1%～22.3%[2]。一項多中心的研究顯示，老年患者在接受非心臟手術治療后，25.8%的患者在術后一周罹患POCD，9.9%的患者在術后3個月持續存在認知功能障礙[3]。目前對于術后認知功能障礙的病理改變仍未闡明。tau蛋白磷酸化后形成神經纖維纏結是阿爾茲海默病的主要病理改變之一，有文獻表明，tau也參與了術后認知功能障礙的發生發展[4]。高磷酸化的tau在海馬區聚集后會引起線粒體結構和功能障礙，還會導致神經元樹突棘數量減少，最終導致認知功能下降[5]。自噬是清除胞內高磷酸化tau的主要途徑，正常的自噬功能可以清除胞內高磷酸化的tau蛋白，降低其對神經元的損傷并改善認知功能[6]。伐尼克蘭是一種α4β2煙堿型乙酰膽堿受體亞型的部分激動劑，通過前期實驗，我們發現伐尼克蘭可通過減少tau的錯誤定位和神經元凋亡改善認知功能[7]。而伐尼克蘭改善術后認知功能障礙是否與降低海馬組織中高磷酸化的tau含量有關還無相關研究。本實驗擬評估伐尼克蘭對老年小鼠術后認知功能障礙的影響，并進一步研究其相關機制，為臨床研究提供參考。

1 材料

1.1 試劑七氟醚(83291，艾伯維)，RIPA裂解液(P0013B，碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012，碧云天)，AT8抗體(MN1020，Thermo Fisher Scientific)，STAT3抗體(9139，Cell Signaling Technology)，p-STAT3(Tyr705)抗體(9145，Cell Signaling Technology)，PKR抗體(184257，abcam)，p-PKR抗體(3076， CST)， GAPDH抗體(5014，Cell Signaling Technology)，LC3B抗體(3868，Cell Signaling Technology)，actin抗體(66009-I-Ig，Proteintech)，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(ZB-2305，中杉金橋)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301，中杉金橋)，ECL顯影液(34095，Thermo Fisher Scientific)，抗熒光淬滅封片液(P0126，中杉金橋)，Alexa Fluor 568和488二抗購自 Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 儀器多通道小動物麻醉機(R550，瑞沃德)，七氟醚蒸發器(R582S，瑞沃德)，Y迷宮和新物體識別實驗裝置購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，凝膠圖像分析系統購自上海天能科技有限公司，激光共聚焦顯微鏡(LSM880，蔡司，德國)由安徽醫科大學科研實驗中心提供。

2 方法

2.1 實驗動物及分組SPF級♂健康C57BL/6J小鼠40只，18月齡，體質量(27.5 ± 2.5)g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法將小鼠隨機分為4組(n=10)：對照組(CON)、剖腹探查組(LAP)、伐尼克蘭+剖腹探查組(Var + LAP)和伐尼克蘭組(Var)。CON組不進行手術，從術前1 d給予生理鹽水(與伐尼克蘭等量)灌胃；LAP組七氟醚麻醉下行剖腹探查，從術前1 d給予生理鹽水(與伐尼克蘭等量)灌胃；Var + LAP組在剖腹探查術前1 d給予伐尼克蘭溶液(1 mg·kg-1·d-1)灌胃；Var組不進行手術，從術前1 d給予伐尼克蘭溶液(1 mg·kg-1·d-1)灌胃，所有小鼠灌胃均持續至術后d 13。

2.2 小鼠POCD模型制備參照文獻[8]將小鼠置于嚙齒動物吸入麻醉裝置，用4%～5%七氟醚麻醉誘導和維持，氧流量為0.8 L·min-1。麻醉后，將小鼠仰臥位固定于手術臺上，腹部消毒備皮，沿腹中線行2.5 cm縱向切口，將大約10 cm的腸袢拉出體外劇烈摩擦30 s并置于體外1 min，之后將腸袢放回到腹腔中并用無菌鉻腸縫合線縫合腹膜、腹部肌肉和皮膚。在手術過程中，監測小鼠的呼吸節律和頻率，以及爪子的顏色，整個手術過程盡量在15 min內完成。

2.3 Y迷宮實驗Y迷宮實驗被廣泛用于評估嚙齒動物的空間工作記憶。Y迷宮實驗裝置由3個尺寸為34 cm(長)×10 cm(寬)×10 cm(高)的帶蓋塑料臂組成，互成120°，其中兩臂為黑色，底部連續排布有不銹鋼線管，連接(2Hz， 40±5V)的電箱；另一個臂為白色，蓋子透明，室內光線可進入，底部未排電線。整個實驗分為兩個階段：術前4 d為訓練期，術后d 14為實驗期。訓練時將小鼠放入迷宮三臂交匯處，允許其在迷宮內自由活動、適應8 min，之后將小鼠面朝墻壁輪流放入兩個黑色臂中的一個的末端，立即給予10 s/ 2 Hz/ 40±5 V的電刺激，小鼠逃避到白色臂記為正確反應，在白色臂休息30s后，進行下一次訓練。在兩個黑色塑料臂間隨機選擇放置小鼠，直到小鼠在10次訓練中有9次為正確反應。否則增加電刺激次數直到小鼠學會為止。實驗時采用同樣電刺激方式，記錄每次電刺激時小鼠逃避到白色塑料臂所需時間為進洞潛伏期，10次電刺激中錯誤反應的次數為逃往安全區的錯誤次數，作為評價記憶能力的參數。

2.4 新物體識別實驗(novel object recognition task，NOR)新物體識別實驗用于評估動物在環境中識別新物體的能力，術后d 10開始進行新物體識別實驗，持續3 d。實驗包括3個階段：在適應階段，將小鼠放在沒有物體的開放場地中適應24 h；在記憶階段，將兩個完全相同的物體放置于箱體中間(與四壁等距)，將小鼠沿著箱體一面中間等距位置面壁放于箱中，記錄10 min內小鼠對物體的探索時間和次數(納入標準為小鼠的嘴巴或者鼻子靠近物體約2 cm范圍之內)；實驗階段的步驟與記憶階段相同，只是將兩個物體中的一個換為一個不同材質、形狀、顏色的物體，記錄10 min內小鼠對新、舊物體的探索時間和次數。用辨別指數(discrimination index，DI)評估評小鼠的學習與記憶能力，辨別指數=(新物體探索時間-舊物體探索時間)÷(新物體探索時間+舊物體探索時間)。

2.5 全蛋白制備及Western blot檢測待行為學測試完成后用二氧化碳窒息處死小鼠，冰上取右側海馬組織，立即用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中在冰上機械研磨海馬組織來制備全蛋白裂解物，BCA方法蛋白定量后進行蛋白質印跡分析(n=6)，將全蛋白裂解物加入10%聚丙烯酰胺凝膠中，50 V電泳30 min， 90 V電泳90 min，恒壓100 V濕轉2 h將蛋白轉移到PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫封閉非特異性結合位點2 h，然后將PVDF膜置于特異性一抗中，4 ℃孵育過夜。洗膜后將PVDF膜置于辣根過氧化物酶偶聯的相應二抗中，室溫孵育1 h。化學發光顯現免疫反應性條帶信號強度，以β-actin或GAPDH作為內參，Image-J軟件測量灰度值。

2.6 免疫熒光檢測小鼠二氧化碳窒息后，生理鹽水灌流，取下左側腦組織，OCT包埋后，液氮梯度速凍，連續冠狀位切片，厚度15 μm，10%山羊血清室溫下封閉非特異性結合2 h，經特異性一抗4 ℃下孵育過夜，PBS洗后與特異性Alexa Fluor 568和488二抗室溫孵育2 h，再孵育DAPI 15～20 min，用抗熒光淬滅封片液封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察海馬組織CA3區陽性細胞。

3 結果

3.1 伐尼克蘭對POCD模型小鼠認知功能的影響如Fig 1所示，與對照組小鼠比較，剖腹探查組小鼠在Y迷宮實驗中逃往安全區的錯誤次數明顯增加(P<0.01)、進洞潛伏期延長(P<0.05)，在新物體識別實驗中的辨別指數降低(P<0.01)，表明剖腹探查引起小鼠認知功能下降，學習與記憶能力受損；與剖腹探查組比較，伐尼克蘭加剖腹探查組小鼠逃往安全區的錯誤次數明顯降低(P<0.01)、進洞潛伏期縮短(P<0.05)，辨別指數明顯增加(P<0.01)，表明圍術期給予伐尼克蘭后，小鼠認知功能障礙得以改善，學習與記憶能力增強。伐尼克蘭組逃小鼠往安全區的錯誤次數、進洞潛伏期和辨別指數差異無統計學意義。

Fig 1 Effects of varenicline on behavioral experiments n=10)

A: Number of error; B: Latency; C: Discrimination index.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLAP

3.2 伐尼克蘭對POCD模型小鼠海馬組織AT8和LC3B表達水平的影響Western blot檢測小鼠海馬組織中AT8和LC3B總蛋白在各組的表達。如Tab 1所示，與對照組比較，剖腹探查組小鼠海馬組織中AT8表達增加、LC3B表達降低(P<0.01)，表明剖腹探查可以引起tau磷酸化程度增加，而自噬功能發生障礙；圍術期給予伐尼克蘭后，AT8表達降低、LC3B表達增加(P<0.01)，表明伐尼克蘭可以恢復正常的自噬功能，減少高磷酸化tau的含量；伐尼克蘭組AT8和LC3B的蛋白表達差異無統計學意義。

Tab 1 Effects of varenicline on expression of AT8 and LC3B in hippocampus n=6)

**P<0.01vsCON;##P<0.01vsLAP

免疫熒光染色檢測小鼠海馬組織CA3區AT8和LC3B分別在核內和胞質的表達。如Fig 2所示，與對照組比較，剖腹探查組小鼠海馬CA3區AT8核內表達增加、LC3B在胞質的表達減少；圍術期給予伐尼克蘭處理后，AT8核內表達減少、LC3B胞質表達增加。與對照組比較，伐尼克蘭組AT8和LC3B在CA3區的表達無明顯變化。

Fig 2 Effects of varenicline on expression of AT8 and LC3B in CA3 region of hippocampus (n=6)

Expression of AT8 (green) and LC3B (red) in the CA3 region of hippocampus; Nuclei were stained with DAPI (blue).

3.3 伐尼克蘭對POCD模型小鼠海馬組織PKR/STAT3信號通路的影響免疫熒光雙標記檢測PKR和STAT3在小鼠海馬CA3區的相互作用。如Fig 3所示，與對照組比較，剖腹探查組小鼠海馬組織中PKR和STAT3的共定位增多；圍術期給予伐尼克蘭處理后，PKR和STAT3的共定位減少。

Western blot 結果顯示，海馬組織中PKR和STAT3總蛋白的表達在各組間差異無顯著性。如Fig 4所示，與對照組比較，剖腹探查組小鼠海馬組織中p-PKR表達增加、p-STAT3表達降低(P<0.05)，表明剖腹探查會引起PKR活性增強，而STAT3活性降低；給予伐尼克蘭后，p-PKR表達降低、p-STAT3表達增加(P<0.05)，表明圍術期給予伐尼克蘭可以降低PKR活性，增加STAT3活性。與對照組比較，伐尼克蘭組p-PKR表達降低(P<0.05)，p-STAT3的蛋白表達差異無統計學意義。

Fig 3 Effects of varenicline on co-localization of PKR and STAT3 in CA3 region of hippocampus (n=6)

Expression of PKR (green) and STAT3 (red) in CA3 region of hippocampus; Nuclei were stained with DAPI (blue).

4 討論

伐尼克蘭是一種新合成的高選擇性α4β2-煙堿型乙酰堿受體亞型的部分激動劑，于2006年獲FDA批準作為一種戒煙藥物使用。有研究表明，急性注射伐尼克蘭可以改善認知功能障礙[9]，并且對記憶能力產生增強作用[10]。本實驗中，Var + LAP組和Var組從術前1 d給予伐尼克蘭(1 mg·kg-1·d-1)灌胃，持續至術后d 13；另外兩組用等量生理鹽水進行灌胃。于術后d 10～12進行新物體識別實驗和d 14進行Y迷宮實驗檢測小鼠認知功能的改變。實驗結果顯示，LAP組的小鼠逃往安全區的錯誤次數增加、進洞潛伏期延長和辨別指數下降，提示剖腹探查可以引起術后認知功能障礙。圍術期給予伐尼克蘭后，小鼠在Y迷宮實驗和新物體識別實驗中的錯誤次數降低、進洞潛伏期縮短和辨別指數增加，表明伐尼克蘭可以改善術后認知功能障礙。

有文獻表明，剖腹探查引起的認知功能障礙與高磷酸化tau的神經毒性相關[11]。tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白，其主要生物學功能是促進微管組裝和維持微管的穩定性，維系神經元骨架系統的穩定。通過合成和降解維持tau的適當水平對細胞的健康至關重要。在阿爾茲海默病及其他tau蛋白病中，tau的磷酸化程度和認知功能障礙程度呈正相關[12]。自噬是一種進化上保守的降解途徑，自噬的主要功能是通過降解胞內異常聚集的蛋白質和已經損傷的細胞器來達到維持胞內大分子和細胞器功能正常的作用。在神經元中，自噬可以清除高磷酸化的tau蛋白，降低其神經毒性，改善認知功能[13]。當自噬功能被抑制后，tau會發生聚集并且無法被清除，最終導致細胞死亡[14]。LC3B是自噬的標記物，其表達水平的變化可以反映自噬功能的變化。本實驗通過對LC3B的表達進行檢測，結果表明，剖腹探查會降低LC3B的表達，導致自噬功能障礙；而給予伐尼克蘭灌胃后，LC3B含量增加，自噬功能得到改善。AT8是tau在S202/T205位點磷酸化的產物，其表達水平可以反映tau的磷酸化程度。本實驗結果發現，在POCD中，AT8含量增加，給予伐尼克蘭后，AT8表達降低，其表達水平的變化與自噬功能的變化一致。

Fig 4 Effects of varenicline on expression of p-PKR and p-STAT3 in hippocampus n=6)

A: Expression of p-PKR and PKR proteins examined by Western blot in the hippocampus; B: Ratio of p-PKR and PKR proteins expression; C: Expression of p-STAT3 and STAT3 proteins examined by Western blot in the hippocampus; D: Ratio of p-STAT3 and STAT3 proteins expression.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsLAP

STAT3是一種信號傳導及轉錄激活因子,可以調控自噬功能。近年來有研究表明，PKR和STAT3結合后，可以抑制自噬功能[15]。為進一步探討伐尼克蘭調節自噬的機制，我們用免疫熒光雙標記檢測PKR和STAT3在海馬組織的表達，并用Western blot檢測p-PKR和p-STAT3在海馬組織的表達。實驗結果表明，伐尼克蘭可以減少PKR和STAT3的結合，降低其復合物對自噬的抑制作用，增加STAT3的活性，改善POCD中的自噬功能。

綜上所述，本研究發現，伐尼克蘭可以通過PKR/STAT3通路調節自噬功能，降低海馬組織中高磷酸化tau的含量，改善術后認知功能障礙。

(致謝：本實驗在麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室和安徽醫科大學第二附屬醫院中心實驗室完成，感謝所有實驗參與人員的大力幫助！)