卵母細胞的脫顆粒時間對胚胎質量和ICSI妊娠結局的影響

王雪，肖亞玲，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內分泌與生殖中心，北京 100730)

1992年，Palermo等[1]首次將卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術應用到輔助生殖技術(ART)領域，ICSI已經成為治療男性因素不育的有效措施。在ICSI操作前，需要剝除卵母細胞周圍的顆粒細胞，一方面顆粒細胞會阻礙注射針，干擾卵母細胞注射，另一方面去除顆粒細胞后可以清楚地評估卵母細胞的減數分裂狀態(tài)。在胚胎學實驗室，胚胎學家習慣性在獲卵和卵母細胞脫顆粒以及卵母細胞脫顆粒和ICSI之間等待一定的時間，原因是卵母細胞在獲卵后可能需要一定的時間來恢復。然而，對于所有操作的精確時間尚無定論。有研究認為卵母細胞脫顆粒時間和ICSI時間對成熟卵率無影響，但是對受精率有顯著影響，認為脫顆粒前的孵育時間越久受精率越高，但要控制在3 h內，而脫顆粒后立即行ICSI能夠達到最優(yōu)受精率[2-3]。還有研究發(fā)現延遲脫顆粒可以顯著提高優(yōu)質囊胚形成率[4]。而有一些研究則發(fā)現卵母細胞脫顆粒時間對ICSI結局無影響，認為脫顆粒時間和ICSI時間對受精率和臨床結局的影響不大[5-6]。考慮到這些結論的不一致性，本研究的目的是對獲卵-脫顆粒和脫顆粒-ICSI之間的時間對ICSI結局的影響進行分析，為確定操作的最佳時間提供依據，從而進一步改善ICSI結局。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年3月至2018年1月在本院輔助生殖中心進行ICSI治療的380例患者(408個周期)的臨床資料。患者納入標準：(1)男方因素不育；(2)前次IVF治療失敗史；(3)年齡<42歲。排除標準：(1)合并存在內科疾病的患者，如高血壓、糖尿病、肝臟疾病、甲狀腺功能異常等；(2)存在腫瘤病史的患者；(3)存在夫妻雙方染色體異常者；(4)卵巢儲備功能下降(獲卵數<5個)者；(5)行胚胎植入前遺傳學篩選的患者；(6)行附睪穿刺取精患者。

二、研究方法

1. 促排卵及取卵：選擇本中心常規(guī)的促排卵方案，包括激動劑長方案和拮抗劑方案，使用卵泡刺激素(FSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)進行卵巢刺激。當有3個卵泡直徑達到18～20 mm時注射HCG(艾澤，250 μg/支，Serono，瑞士)250 μg，此后38 h經陰道超聲引導下取卵。

2. 脫顆粒細胞及ICSI操作：按照本實驗室的工作常規(guī)，將獲得的卵母細胞放入受精液(G-IVF Plus，Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)一段時間，再將其放入透明質酸酶(hyaluronidase，80 U/ml，Vitrolife，瑞典)中消化片刻，時間控制在30 s內，然后將其吸出放入受精液中，用不同孔徑的毛細管不斷吹打，直至完全去除顆粒細胞。將拆除顆粒細胞的卵母細胞放入CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，準備進行ICSI。每次操作前記錄時間。進行ICSI操作前，在7%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Vitrolife，瑞典)液滴中選擇形態(tài)正常、活動力好的精子進行制動，然后將卵母細胞放置培養(yǎng)液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中，進行ICSI操作。單精子注射時，用固定針將卵母細胞固定，并將極體放置12點位置，注射針從3點位置進入，回吸，確認卵母細胞膜破裂后將精子注入卵母細胞胞漿內，緩慢退出注射針。將注射完的卵母細胞用卵裂期培養(yǎng)液(G1，Vitrolife，瑞典)充分沖洗，并放置提前配置好的G1培養(yǎng)液中，放入37℃、6%CO2、5%O2的三氣培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

3. 胚胎的觀察和評估：ICSI后的16～18 h(受精后第1天)觀察卵母細胞的受精情況，并換液，繼續(xù)用卵裂期培養(yǎng)基培養(yǎng)，第3天觀察卵裂球的分裂情況，根據胚胎卵裂球數目、細胞質均一性、碎片多少等進行胚胎評分，我們將卵裂球數目為6或8，評級為Ⅰ或Ⅱ的胚胎定義為優(yōu)質胚胎。在移植日挑選質量最好的2枚胚胎進行移植，其他胚胎轉移至囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)。如果移植當日因特殊情況不能移植者，將此兩枚胚胎冷凍保存或繼續(xù)培養(yǎng)。在受精后第5日或第6日觀察囊胚形成情況，并根據Gardner評分法[7]進行評分，挑選內細胞團質量達到A或B級的囊胚進行冷凍，C級的囊胚放棄，滋養(yǎng)細胞層的質量不限。具體的冷凍操作方法按照本中心常規(guī)進行。

4. 妊娠結局的判斷及觀察指標：移植后第7日檢測血清HCG水平，HCG>5 U/L判斷為生化妊娠；移植后4周行超聲檢查，超聲下可見胎心及胎囊者判斷為臨床妊娠。受精率=正常受精數/MⅡ卵母細胞數×100%；優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數/卵裂數×100%；囊胚形成率=囊胚數/(卵裂數-移植數-卵裂期冷凍數)×100%；種植率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數/移植周期數×100%；活產率=隨訪獲得活產的總例數/移植周期數×100%。

5. 分組標準：取卵至脫顆粒的時間定義為T1，脫顆粒至ICSI的時間定義為T2，取卵至ICSI的時間定義為T3(具體示意見圖1)。本研究中T1平均值為(0.56±0.30)h(0.08～1.92 h)，因此將患者分為3組，分別為A1組≤0.5 h，B1組0.5～1.0 h，C1組≥1 h。T2的平均值為(2.13±0.87)h(0.33～6.05 h)，據此將患者分為3組：A2組≤2 h，B2組2～3 h，C2組>3 h。T3的均值為(2.69±0.87)h(0.67～6.77 h)，亦將患者分為3組：A3組≤2.5 h，B3組2.5～3.5 h，C3組>3.5 h。

圖1 T1和T2的定義示意圖

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般情況

本研究共納入380例患者(408個ICSI周期)的資料，平均年齡(34.7±4.1)歲。共移植350個周期，超聲下見到妊娠囊182個，種植率為25.4%(182/717)，145例患者獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為41.4%(145/350)，妊娠后流產30例，流產率為20.7%(30/145)，宮外孕發(fā)生率為0.29%(1/350)，活產率為32.0%(112/350)。

二、不同組別間胚胎發(fā)育情況及妊娠結局比較

1.取卵-脫顆粒時間對胚胎發(fā)育及妊娠結局的影響：不同T1時間的3組中的年齡、不育年限、FSH應用總劑量及拮抗劑方案比例比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)；3組間的受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率、流產率和活產率比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)(表2)。

2.脫顆粒-ICSI時間對胚胎及妊娠結局的影響：不同T2時間的3組間年齡、不育年限及FSH應用總劑量比較均無顯著性差異(P>0.05)，3組間的拮抗劑方案比例比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表3)。3組間的受精率比較有顯著性差異，C2組顯著高于A2組和B2組(P<0.05)；囊胚形成率3組間比較亦有顯著性差異，C2組顯著高于A2組(P<0.05)；3組間的優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率、流產率及活產率比較均無顯著性差異(P均>0.05)，但B2組的種植率、臨床妊娠率和活產率有略高于其他兩組的趨勢(表4)。

表1 不同T1三組間一般情況的比較[(-±s)，%]

表2 不同T1三組間胚胎發(fā)育及妊娠結局比較(%)

表3 不同T2三組間一般情況的比較[(-±s)，%]

表4 不同T2三組間胚胎發(fā)育及妊娠結局比較(%)

3.取卵-ICSI時間對胚胎及妊娠結局的影響：3組間的年齡、不育年限及FSH應用總劑量比較均無顯著性差異(P>0.05)，3組間的拮抗劑方案比例比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表5)。3組間的受精率比較有顯著性差異，C3組顯著高于A3組和B3組(P<0.05)；3組間的囊胚形成率比較無顯著性差異，C3組有略高于A3和B3組的趨勢(P>0.05)；3組間的優(yōu)胚率、種植率、臨床妊娠率、流產率及活產率比較均無顯著性差異(P均>0.05)，但B3組的種植率、臨床妊娠率和活產率有略高于其他兩組的趨勢(表6)。

表5 不同T3三組間一般情況的比較[(-±s)，%]

表6 不同T3三組間胚胎發(fā)育及妊娠結局比較(%)

討 論

目前ICSI操作技術已經日趨成熟，但是脫顆粒時間和顯微注射時間對ICSI結局的影響一直存在爭議。早期的研究發(fā)現適當延長取卵后脫顆粒前的時間有利于卵母細胞胞漿和胞核的成熟，推薦獲卵后2 h后再進行脫顆粒，從而使ICSI結局最優(yōu)[2，3，8]。但也有一些研究認為脫顆粒時間對ICSI結局無影響[5-6]。目前，對于所有操作的精確時間尚無確切定論。本研究的目的是分析脫顆粒細胞時間(T1)和ICSI時間(T2)對胚胎發(fā)育和妊娠結局的影響。

在本研究中，我們發(fā)現在獲卵后0.08～1.92 h內進行脫顆粒不會影響ICSI的結局。過早的拆卵(≤0.5 h)和延遲拆卵(≥1 h)對胚胎的發(fā)育潛能沒有明顯影響，3組的優(yōu)胚率、囊胚形成率和種植率相似；對臨床結局也沒有明顯影響，3組的臨床妊娠率和活產率相似。這與之前的一些研究結論是相似的，認為在ICSI前延遲脫顆粒細胞不會提高ICSI結局[6，9]。在2016年Bárcena等[6]的研究中納入近4 000個ICSI周期，他們發(fā)現獲卵與脫顆粒之間的時間與ICSI結局無顯著關系，他們認為高質量的卵母細胞體外承受能力更強，更耐受體外的各種操作，而不影響臨床結局。最近Naji等[9]進行了一項研究，納入2 051個非供卵的ICSI周期，根據取卵至脫顆粒的時間分為兩組，發(fā)現脫顆粒時間在2 h以內或以上的兩組的受精率、種植率、臨床妊娠率和活產率比較無顯著性差異；在第一組中他們又進一步分為脫顆粒時間在30 min以內和30～119 min的兩組，同樣發(fā)現兩亞組的數據也無顯著性差異。然而我們的研究結論也與之前的一些研究相反，即他們認為在脫顆粒之前，將卵母細胞培養(yǎng)2 h以上可以提高受精率和胚胎質量，改善妊娠結局[2]。Mizuno等[4]發(fā)現，取卵后立即脫顆粒細胞組與2 h脫顆粒細胞組的受精率、囊胚形成率、妊娠率及活產率比較無顯著性差異，但是2 h脫顆粒細胞組的優(yōu)質囊胚率顯著高于立即脫顆粒細胞組(P<0.05)，認為在ICSI之前保持完整的顆粒細胞有利于卵母細胞的成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育。分析本研究與其他研究的差異，可能存在以下幾點原因：首先，由于本實驗室的工作安排，我們的脫顆粒時間為0.08～1.92 h，最高不超過2 h，因此未能評估脫顆粒時間超過2 h的情況；對于0.08～1.92 h內脫顆粒者，本研究提示取卵-脫顆粒時間短者的種植率、臨床妊娠率和活產率略高于脫顆粒時間久者，盡管3組間比較無顯著性差異(P>0.05)。最近關于鼠類的研究提示，有完整顆粒細胞的卵母細胞延長培養(yǎng)后會誘導卵母細胞出現凋亡改變，促進卵母細胞老化，從而影響胚胎質量和臨床結局，建議在取卵后立即進行脫顆粒[10-11]。其次，很多研究是在HCG后(36.5±0.5)h進行取卵[2，6，12]，而本研究是在HCG后38 h取卵，相當于上述研究的卵母細胞取出后在體外培養(yǎng)2 h后，似乎我們的取卵-脫顆粒時間較短，實際上距離HCG的時間并不短，卵母細胞的成熟度相對較好。因此，本研究認為取卵至脫顆粒的時間對胚胎發(fā)育和妊娠結局的影響并不顯著。

脫顆粒后應該立即進行ICSI操作還是應該放置一段時間一直存在爭議。有研究認為脫顆粒時間至ICSI時間的長短與ICSI結局無關[13]。Garor等[5]在脫顆粒后5 min～5.2 h進行ICSI操作，以≤1 h和>1 h分為兩組，發(fā)現兩組的受精率和妊娠率相似。認為ICSI之前延長卵母細胞的孵育時間并不能提高卵母細胞的發(fā)育程度，也不能改善妊娠結局。但也有研究發(fā)現脫顆粒后立即行ICSI能夠獲得較好的結局。Patrat等[2]研究發(fā)現脫顆粒至ICSI注射時間與受精率成負相關，隨著脫顆粒至ICSI注射時間的延長，受精率逐漸下降，因此建議在脫顆粒后立即進行精子注射。最近Pujol等[12]進行了一項多因素的分析發(fā)現脫顆粒時間(0.5～2 h)對妊娠結局無影響，但是脫顆粒-ICSI時間每增加1 h，生化妊娠率和臨床妊娠率分別降低7.5%和7.9%，而對繼續(xù)妊娠率和活產率沒有影響，也建議在脫顆粒后立即行ICSI操作。在本研究中，根據本實驗室的工作安排，我們的T2時間為0.33～6.05 h，其中脫顆粒后短時間內(<1 h)行ICSI的僅10例，所以我們按照T2的平均時間(2 h)進行分組，我們發(fā)現C2組(>3 h)的受精率顯著高于A2和B2組，C2組的囊胚形成率顯著高于A2組(P<0.05)；而B2組的種植率、妊娠率及活產率略高于其他兩組，但3組間比較無顯著性差異(P>0.05)。另外本研究還對取卵和ICSI之間的時間進行了分析，發(fā)現當T3超過3.5 h時(C3組)的受精率最好；盡管3組間尚無顯著性差異(P>0.05)，但B3組的妊娠率及活產率有略高于其他兩組的趨勢。這與上述以脫顆粒為節(jié)點進行的研究結論相一致，與Bárcena等[6]的研究結論也相似，他們認為不管是新鮮周期還是復蘇卵母細胞周期，取卵至ICSI的時間對妊娠率和活產率均無顯著影響。這可能是因為在脫顆粒操作中，由于透明質酸酶的化學損傷和吸管吹吸的機械損傷，導致卵母細胞膜受損或卵母細胞內部細胞器受到擠壓，因此，脫顆粒后給予卵母細胞一段恢復時間后再進行ICSI比較合理。且ICSI前對卵母細胞進行適度時間的孵化可能促進細胞質的成熟，更有利于卵母細胞的全面激活和后續(xù)正常發(fā)育，可能增加受精率。然而脫顆粒后的孵化時間不宜過久，否則會造成卵母細胞老化，卵母細胞內的超微結構發(fā)生改變，基因表達改變，紡錘體異常的發(fā)生率增加[14-16]，從而影響后續(xù)胚胎發(fā)育。本研究中>3 h的患者例數相對較少，可能會存在一定偏倚。

本研究對臨床和實驗室工作具有較重要的意義。對于極度繁忙的IVF中心，尤其是需要下午取卵的中心，如果能夠縮短取卵至ICSI之間的時間而又不影響ICSI結局，可以避免實驗室從業(yè)人員工作時間的顯著延長，提高實驗室工作效率，從而降低ICSI周期的總體成本[17]。本研究認為獲卵后脫顆粒時間對ICSI結局的影響并不顯著，脫顆粒后孵育2～3 h再進行ICSI的效果可能更好，但尚未表現出顯著性差異，因此具體操作時間還有待于進一步研究。當然，本研究的樣本量有限，后續(xù)還需要進行前瞻性的隨機對照研究來進一步證實。