精子DNA碎片對體外受精-胚胎移植妊娠結局的影響

譚志國，孫健，張丹，馮娜，黃衛東

(新疆佳音醫院生殖醫學中心，烏魯木齊 830001)

在男性不育的檢查中，精液常規分析目前仍是評估男性不育的重要參考指標，但精液常規分析不能全面地反應精子的質量和功能。在胚胎發育過程中，精子會向胚胎提供一半的遺傳物質，其染色質結構的正常與否對精子的受精能力、胚胎的發育以及后期的臨床妊娠起著重要的作用[1]。精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)是精子發生過程中產生的一種正常產物，含量在正常精子核遺傳物質中所占比例較小，如果精子在發生過程中受到外界有害因素干擾，則會導致SDF的含量急劇增多，影響男性的生育能力[2]。精子DNA完整性的評估指標為DNA碎片指數(DNA fragmentation index，DFI)，本研究旨在研究接受輔助生殖治療夫婦的男性SDF程度對IVF-ET過程中受精、卵裂、胚胎發育潛能及妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象與分組

收集2016年10月至2018年12月在新疆佳音醫院生殖醫學中心進行輔助生殖治療的不育夫婦為研究對象，男女雙方排除輔助生殖禁忌證和染色體異常。納入標準：(1)女方年齡<37歲；(2)女方抗苗勒氏管激素(AMH)>1.1 ng/ml，取卵當日獲卵數>5個；(3)女方因輸卵管因素導致不孕；(4)最終助孕方案為IVF；(5)第3天移植日有新鮮卵裂期胚胎移植。排除標準：(1)男方精液檢查少精子癥、弱精子癥及畸形精子癥患者；(2)凍胚移植和新鮮囊胚移植病例。

共有1 041對夫婦(共1 041個周期)納入該研究，根據男方入院時生育力評估檢測的DFI值，將研究對象分為4組：DFI<10%組(n=277)、10%≤DFI<20%組(n=480)、20%≤DFI<30%組(n=183)及DFI≥30%組(n=101)。

二、研究方法

1.精液采集與分析：男方禁欲2～7 d，手淫法取精，待精液液化后，按世界衛生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版標準進行觀察分析計數，根據計數的精液濃度，取一定量精液稀釋至100 μl，調整精子濃度為1～2×106個/ml。

2.精子DFI的檢測：采用精子染色質結構分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)，精子DNA碎片檢測試劑盒由浙江星博生物科技有限公司提供，試劑盒組成包括：A液、B液、C1液、C2液(含吖啶橙)。在流式細胞儀(FACSCalibur，BD公司，英國)的進樣管中加入100 μl精液與A液的混合液后，加200 μl B液混勻，30 s后立即添加600 μl染色液(C1+C2液)混勻，上樣，系統數據收集5 000個精子自動停止，完成檢測。

3.精液處理方法：取卵當日精液處理方法為密度梯度離心加上游法，胚胎培養試劑及精液處理試劑均為SAGE公司商品化試劑，患者取卵當日手淫取精，精液于37℃培養箱中液化后，鏡下觀察并記錄精液常規，分別取80%梯度試劑和40%梯度試劑各1.5 ml，加入15 ml離心管內使之形成界面清晰的兩層，再加入1.5～3.0 ml液化后的精液，100g離心20 min后，沉淀混勻后100g5 min離心2次，收集精子沉淀后于培養箱中上游待用。

4.IVF、胚胎觀察與移植：卵母細胞受精時間為絨毛膜促性腺激素(HCG)注射后約39 h，4 h后拆卵觀察是否有第二極體排出，次日晨觀察胚胎原核并進行原核評分，鏡下見原核確定受精。第3天進行胚胎觀察分級，正常受精即原核觀察時為2原核者；細胞數7個以上，卵裂球大小均勻，細胞碎片在0～10%之間為Ⅰ級胚胎，即優質胚胎。移植當日酌情選擇胚胎移植。

5.觀察指標：MⅡ卵率=MⅡ卵數/獲卵數×100%；受精率=(2原核卵母細胞數+1原核卵母細胞數+多原核卵母細胞數+未見原核卵裂卵母細胞數)/IVF受精卵母細胞總數×100%；卵裂率=卵裂胚胎數/受精卵母細胞數×100%；優質胚胎率=D3優質胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統計學處理

結 果

一、4組患者的基本情況比較

統計結果顯示，4組間的男性DFI值差異有統計學意義(P<0.05)；DFI≥30%組女方年齡顯著高于DFI<10%組(P<0.05)；各組間的AMH值及胚胎移植數比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、各組獲卵數及胚胎發育情況比較

不同研究組間，患者獲卵數、MⅡ卵率及卵裂率比較差異無統計學意義(P>0.05)；4組的受精率比較，10%≤DFI<20%組最低，顯著低于DFI<10%組和20%≤DFI<30%組(P<0.05)，但與DFI≥30%組的差異無統計學意義(P>0.05)；優質胚胎率隨DFI升高而降低，DFI<10%組顯著高于10%≤DFI<20%組及DFI≥30%組(P<0.05)，與20%≤DFI<30%組相比差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 各組患者基本情況比較(-±s)

表2 各組患者獲卵數及胚胎發育情況比較[(-±s)，%]

三、各組患者妊娠結局比較

統計結果表明，4組患者的臨床妊娠率及流產率比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者妊娠結局比較(%)

討 論

早在1999年，Evenson等[3]就提出利用SCSA檢測精液樣本對生育的預測作用，并認為對那些沒能獲得妊娠的夫婦而言，這是一個可利用的預測指標。目前，關于SDF的研究眾多，但不同的研究者采用不同的檢測方法，每種診斷方法的檢測目的不同，雖然一些診斷方法之間有一定的相關性，但仍缺乏明確的、有說服力的臨床參考值[4]，研究結果缺乏再現性[5]，使得SDF對胚胎受精、發育以及最終妊娠結局的影響一直存在爭議。Carlini等[6]在一項針對意大利反復流產夫婦的研究中，利用轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(Transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)評估SDF，發現反復流產的夫婦中男性精液SDF值水平與不育組相似，明顯高于正常生育的對照組，但其認為不能單純以SDF作為反復流產風險的預測指標。Oleszczuk等[7]認為當DFI達到40%或更高時，流產率會明顯上升，精子DNA檢測可以作為選擇輔助生殖技術(ART)受精方式的方法，因為對于高DFI的患者，卵胞漿內精子注射(ICSI)可能是更好的治療方法。Kamkar等[8]采用SCSA法和TUNEL法檢測反復流產夫婦男性的SDF，同時檢測精液中自由基和抗氧化劑水平，認為精液的DFI、自由基和抗氧化劑水平與反復自然流產有明顯的相關性。Oehninger等[9]則認為，將DNA碎片分析作為主要的診斷和篩查工具為時尚早。但隨著研究的深入，相信隨著時間的推移以及更多數據的支持，研究者對于精子SDF的預測價值會有一個確定的結論[10]。

本研究顯示各組間女性患者獲卵數、MⅡ卵率比較無顯著性差異，10%≤DFI<20%組受精率最低，與DFI<10%組和20%≤DFI<30%組相比有顯著性差異，這與文獻中精子DFI值影響受精結果[11]、頂體酶活性[12]及精子透明質酸結合能力[13]的結論相反，推測這可能與納入統計的數據量有關。Casanovas等[14]研究認為，即使DNA損傷不能在短時間內修復，胚胎分裂亦可進行，所以各組間卵裂率無明顯差異，但雙鏈的損傷會延續，導致染色體碎片的拆分、重排或復雜重排。雖然本研究中DFI<10%組與20%≤DFI<30%組相比，優胚率無明顯差異，這可能與納入研究的數據量有關，但各組間優質胚胎率隨著DFI的升高而降低。因為即使精子存在DNA損傷，也同樣能夠使卵母細胞受精，當損傷的DNA融合入胚胎的基因組后，會導致復制和轉錄錯誤，導致不同胚胎階段遺傳物質的畸變[15]。雖然有研究認為SDF的升高會對妊娠結局產生不良影響[16]，但本研究顯示，各組間的臨床妊娠率和流產率無顯著性差異，這可能與移植時選擇優質胚胎及移植胚胎數有關，也可能與患者年齡較小有關。

本研究的局限在于影響男性精子DFI值的因素較多，如精索靜脈曲張[17]、超負荷的運動[18]、減肥[19]、禁欲時間[20]等，尤其是禁欲時間。Brandley等[21]認為，對于DFI高的患者，通過重復射精后再檢測其DFI值，可能會出現DFI值下降的現象。本研究并未對患者的禁欲時間進行比較，如果能在取卵當日明確其禁欲時間同時檢測其精液DFI值，就能更有效地證明DFI值與胚胎質量及妊娠結局的關系。另外，本研究納入的研究對象為移植日有優質胚胎的人群，對于那些無優質胚胎移植的患者，是否存在更明顯的DFI值變化趨勢，仍需進一步研究。

綜上所述，本研究認為對于年齡小于37歲、接受IVF的女性患者，優質胚胎率會隨著DFI的升高而降低，而DFI對于臨床妊娠和流產尚未見明顯影響。但鑒于研究對象的納入和選擇限制，仍需要擴大樣本量，將研究人群和對象覆蓋的更廣泛，以期得到更可靠的研究結論。