擬南芥At5g58100基因T-DNA純合插入突變體PCR鑒定及表型觀察

劉瑤 劉春宏 龐朝廷 高菊芳

摘 要： 以擬南芥SPOT1功能缺失突變體spot1和野生型（WT）植株為材料，比較研究了它們在花粉發育和結實率方面的差異.spot1-1，spot1-2和spot1-3突變體都能形成可育的三核花粉，但用掃描電子顯微鏡 （SEM） 觀察發現其花粉粒皺縮，花粉外壁存在紋理缺陷.用熒光顯微鏡觀察了這些花粉粒的樹脂半薄切片，發現花粉內壁無纖維素的自發熒光，spot1突變體成熟果莢中的種子數量顯著少于野生型.對spot1-3突變體花藥發育過程進行觀察后發現，從花粉母細胞時期開始，突變體細胞壁組成與野生型已出現差異.10 μmol·L-1（物質的量濃度）茉莉酮酸既不能抑制黃化spot1幼苗的頂鉤反應，又不能抑制1×10-6（質量分數）乙烯利引起的夸張頂鉤反應.上述結果提示SPOT1基因的功能與小孢子初生外壁、花粉內壁的發育，以及花絲伸長（長度）有密切關系，SPOT1可能與茉莉酮酸信號傳導通路相關聯.

關鍵詞： 初生外壁; 花粉內壁; 花絲伸長; 頂鉤反應; 茉莉酮酸

中圖分類號： Q 78; Q 943 ?文獻標志碼： A ?文章編號： 1000-5137（2019）05-0503-08

Abstract： The differences between the spot1 mutants and wild type （WT） in their pollen development and spikelet fertility were compared in the paper.The pollen grains with spot1 mutants （spot1-1，spot1-2 and spot1-3） were shrunken and spotty in exine pattern by scan electron microscopy （SEM） observation，although they can all develop into male fertile pollens.There was no blue fluorescence in pollen wall at trans-section pollen grains by fluorescence microscope analysis.The average number of seeds in mature fruit pods with mutants is significant less than that of wild type because of insufficient pollination.The earliest change in the cell wall component occurs at the microspore mother cell stage of anther development by observation the sequential transverse sections of the spot1-3 mutant flower inflorescence.10 μmol·L-1 jasmonic acid treatment can neither inhibit the curvature of apical hook of etiolated spot1 mutant seedling，nor inhibit ethylene from promoting the formation of apical hook of etiolated spot1 mutant seedling.The results indicated that the function of SPOT1 gene might involve in the construction development of primexine and intine，and in filament elongation.SPOT1 gene might be related to jasmonic acid signal transduction pathway.

Key words： primexine; intine; filament elongation; apical hook response; jasmonic acid

0 引 言

花粉細胞壁在幫助雄配子抵御環境壓力、微生物侵襲，以及在細胞識別中都起到重要作用.它由來自配子體的花粉內壁和來自孢子體的花粉外壁組成[1-2].當小孢子開始有絲分裂時，會在細胞膜與外壁中間分泌一層致密的物質——內壁.內壁的化學成分主要是果膠和纖維素，其生物化學和結構特征與經典的植物細胞壁類似[3].纖維素的分子結構非常簡單，為不分支的β-1，4-葡聚糖鏈.通常數十條葡聚糖鏈組裝成索狀的結晶態微纖絲，微纖絲將進一步聚集成纖維素的高級結構，成為細胞壁的基本骨架[4].目前對花粉內壁的形成及調控的分子機制所知甚少，由于 3個涉及初生壁纖維素合成酶基因的突變體都是雄性不育突變體，其花粉壁也不正常，因此認為小孢子表面纖維素的沉積對于花粉壁的發育來說至關重要[5].另外，擬南芥中AtUSP是一個編碼UDP-sugar 焦磷酸化酶的基因，突變體表型為外壁正常，而敗育的小孢子內壁特異缺失，其突變體表現出配子體敗育表型[6].

花粉外壁又可分為蜂窩狀的外壁外層以及平坦的外壁內層.外壁外層是由網格狀結構的柱狀結構、頂蓋層，和填充在它們之間空隙的含油層構成.花粉外壁的主要構成是孢粉素[3].研究發現小孢子在四分體 （Tds） 時期形成的暫時細胞壁基質——初生外壁為花粉外壁的形成提供了模板，決定了后期花粉外壁的紋理[7-8].近年來，通過對花粉壁發育缺陷突變體的研究，DEX1，RPG1，NPU，EFD，SPONGY，UPEX等多個與初生外壁發育相關的基因得以被克隆，這些基因的功能缺失突變體在花粉發育過程中均表現出初生外壁的結構異常，從而造成花粉外壁紋理缺陷[9-15].

花絲是開花植物雄性生殖器——雄蕊的組成部分，花絲伸長將花藥托起，使成熟的花粉粒 （PG） 落到柱頭上進而完成授粉受精過程，因此花絲的正常發育對于種子植物繁衍后代至關重要.研究表明：茉莉酮酸（JA） 直接參與調控花藥開裂、花粉成熟和花絲伸長[16-17].

At5g58100基因編碼一種功能未知蛋白，DOBRITSA等[18]在大規模篩選花粉壁發育缺陷突變體時發現At5g58100基因的3個根癌農桿菌DNA（T-DNA）純合插入等位突變獨立株系 （SALK_061320c，SALK_041228和SALK_079847），它們插入At5g58100基因的不同位置，但是均導致花粉外壁的相似表型缺陷——花粉外壁缺乏頂蓋，表明At5g58100基因與孢粉素的沉積模式有關.他們將這種花粉壁發育缺陷突變體命名為spot1突變體.

為了進一步研究At5g58100基因的功能，本文作者觀察了spot1突變體的營養生長和生殖生長過程、花粉發育過程，發現spot1突變體小孢子初生外壁和花粉內壁發育異常，而且由于花開放時花絲伸長（長度）不足造成授粉不足，使突變體的結實率顯著低于野生型 （WT） 的結實率.在此基礎上，利用黃化幼苗的頂鉤反應，觀察了spot1突變體種子對茉莉酮酸處理和乙烯利處理的反應.結果發現10 μmol·L-1茉莉酮酸既不能抑制黃化spot1幼苗的頂鉤反應，也不能抑制1×10-6（質量分數）乙烯利引起的夸張頂鉤反應.上述結果提示SPOT1可能作為茉莉酮酸信號傳導通路的組成成分之一，參與小孢子初生外壁和花粉內壁的發育以及花絲伸長反應.

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）：Columbia（Col）生態型種子，由楊仲南教授實驗室繼代種植培養所得.

將從SALK突變體庫購買的7種At5g58100基因的T-DNA插入突變體（salk-072486，salk-073032，salk-041237，salk-041228，salk-072490，salk-079847，salk-06130c）種子種下，經過掃描電子顯微鏡 （SEM） 篩選、T-DNA插入，鑒定得到At5g58100基因的T-DNA純合插入突變體spot1-1（salk_072490），spot1-2（salk_079847）和spot1-3（salk_061320c）.

植物種植方法參照文獻[19].

1.2 方 法

1.2.1 T-DNA插入及插入位點鑒定

提取野生型和spot1突變體植株DNA的方法參照文獻[19].利用TAIR （http：//www.arabidopsis.org/） 網上提供的引物序列（LB1.3：

ATTTTGCCGATTTCGGAAC;

SALK_079847LP AGCTTGCTCTTTGTGAAGGTG，

SALK_079847 RP CAATGCAGGATCCTCAGAGAG;

SALK_072490LP GCAGTTGCAGGTACTATTCGC，

SALK_072490RP TCCATTCGTCTTAGTGCATCC;

SALK_061320c LP AAAGGAGCCAACCTTGAGAAG，

SALK_061320c RP AAAGAAGCCTTTCCTTGATGC）

分別進行左邊界序列（LP）引物 +右邊界序列（RP）引物和通用（LB）引物+ RP引物聚合酶鏈式反應（PCR），純合插入植株的LB+RP PCR反應產物送上海杰李生物技術有限公司測序，通過旁臨序列分析獲得T-DNA插入位點.

1.2.2 SPOT1基因表達量測定

根據trizol 試劑盒的說明提取野生型和spot1突變體花序RNA，并用DNA酶處理得到純化的RNA，用逆轉錄酶反轉錄成cDNA.根據突變體基因組中T-DNA的插入位點設計3對引物EX13 F TTATCGATTTAACTGCTGGCC，EX15 R CCTTCACAAAGAGCAAGCTTC（spot1-1）;EX17 F AAAATTACACAGTTGCACGC，EX19R ATATGAACGAACAGTCTTCCG（spot1-2）;EX19 F TTAACACTCTCTGAGGATCCTG，EX20 R CCATAATAGTGATCGCCCG （spot1-3）進行逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）.反應體系（20 μL）：SYBR Green I master mix：10 μL，引物F：0.4 μL，引物R：0.4 μL，cDNA：0.7 μL，水：8.5 μL，每對引物重復3次，在ABI PRISM 7300 detection system上進行擴增.以野生型的表達量為1計算突變體的相對表達量.

1.2.3 植株生殖生長和花粉發育觀察

野生型和突變體植株從營養生長過渡到生殖生長后兩周，隨機各抽取10株植株，測定最早出現的5個果莢中的種子數量，求得平均值和標準差;每株選取一朵處于盛開的花，測量四強雄蕊和雌蕊的長度，四強雄蕊的長度取平均值記錄結果.

13期花粉中細胞核的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，花粉外貌的SEM觀察，樹脂半薄切片樣品制備和觀察方法參照文獻[20].

1.2.4 對茉莉酮酸和乙烯利響應能力的觀察

將野生型和spot1突變體種子作除菌處理，春化3 d后播種在1/2 MS培養基、含10 μmol·L-1 JA的1/2 MS培養基、含1×10-6乙烯利的1/2 MS培養基，以及含1×10-6乙烯利+10 μmol·L-1 JA的1/2 MS培養基上，用錫箔紙包裹培養皿，22 ℃培養3 d.每個條件重復3次.培養結束后，在每種條件培育的組中隨機抽取不少于10個幼苗個體，將它們放置于具有黑色背景的培養皿中，在相同放大倍數的解剖鏡下拍照，保存照片.根據照片的比例，測定記錄不同條件下生長的幼苗的頂鉤角度，進行統計分析.通過組間差異顯著性檢驗，判斷spot1突變體對茉莉酮酸和乙烯利的響應能力.

2 結 果

2.1 SPOT1功能缺失突變體的獲得和鑒定

為了獲得SPOT1功能缺失突變體，從SALK突變體庫購買了針對At5g58100基因的7個株系（salk_072486，salk_073032，salk_041237，salk_072490，salk_079847，salk_061320c和salk_041228）的T-DNA插入突變體的種子.植株開花后提取花序總DNA，利用T-DNA上特異性引物LB及基因上的引物LP，RP，從salk_072490，salk_079847，salk_061320c株系中鑒定出了純合的T-DNA插入突變體.用SEM觀察13期花粉的外貌，發現花粉外壁發育缺陷與T-DNA純合插入緊密連鎖，將其分別命名為spot1-1（salk_072490），spot1-2（salk_079847）和spot1-3（salk_061320c）突變體，如圖1（a），1（f）所示.用LB及各自的RP引物擴增得到PCR產物，經瓊脂糖凝膠電泳后，切取含目的片段的瓊脂糖膠，回收后，用T-DNA特異的LB引物進行測序.測序結果經過TAIR數據庫比對，發現spot1-1突變體的T-DNA插在SPOT1基因組的ATG下游3502 bp處（第14個內含子），spot1-2突變體的T-DNA插在該基因ATG下游4453 bp處（第17個內含子），spot1-3突變體的T-DNA插在該基因ATG下游5657 bp處（第20個外顯子），如圖1（b）所示.

為了解T-DNA純合插入對SPOT1基因表達的影響，在3種突變體T-DNA兩側的外顯子序列處，設計了3對引物，分別是spot1-1：EX13F，EX15R;spot1-2：EX17 F，EX19R;spot1-3：EX19 F，EX20 R進行實時定量RT-PCR.qRT-PCR結果顯示：在3種突變體背景下 SPOT1基因在花苞中的表達量顯著下調，如圖1（c）所示.這表明T-DNA的插入導致At5g58100基因在花器官中的正常表達被阻斷.至此，獲得了3個獨立株系的SPOT1功能缺失突變體spot1-1，spot1-2和spot1-3.

2.2 spot1突變體表型的初步觀察

觀察發現spot1突變體在營養生長時期與野生型沒有顯著差異，但在生殖生長時期卻出現了明顯不同，主要表現為spot1突變體果莢短小，成熟花粉皺縮，和花粉外壁紋理缺陷，如圖1（d），1（f）所示，雖然DAPI染色表明13期花藥中的花粉粒均為三核花粉，如圖1（g）所示，亞歷山大染色表明花粉都是可育的，如圖1（e）所示.與野生型盛開的花相比，spot1突變體花的萼片、花瓣及花藥的形態和數目均正常，但是花絲的長度略短.野生型擬南芥花絲頂端的花藥通常高于柱頭，而突變體花絲頂端的花藥剛剛能夠著柱頭或者在柱頭之下，如圖1（h）所示.

統計分析表明野生型每個果莢中的種子數量平均為（28±2）粒，極其顯著地高于spot1-1突變體的（17±5）粒、spot1-2突變體的（9±4）粒和spot1-3突變體的（14±6）粒（表1）.從表1中還可以看到，spot1-1突變體雄蕊與雌蕊長度之差為（0.28±0.13） mm，spot1-2突變體雄蕊與雌蕊長度之差為（-0.10±0.12） mm，spot1-3突變體雄蕊與雌蕊長度之差為（0.15±0.10） mm，與野生型雄蕊與雌蕊長度之差[（0.55±0.12）mm]相比，均具有極其顯著的差異.上述結果表明，spot1突變體雄蕊與雌蕊在生長發育上的不協調，影響了正常的授粉，從而導致結實率的下降.

2.3 spot1突變體花粉內壁結構缺乏纖維素成分

為了尋找造成spot1突變體花粉外壁紋理缺陷的原因，利用熒光顯微鏡技術對spot1-3突變體花序的樹脂半薄連續切片進行了觀察.結果發現：在花藥發育的第6期，野生型擬南芥小孢子母細胞 （MMC） 細胞壁的主要成分是胼胝質，與苯胺藍水溶液反應后，在紫外光激發下發出黃綠色熒光，如圖2（a）所示.而spot1-3突變體小孢子母細胞細胞壁發出的熒光比較弱且偏藍色，如圖2（e）所示，提示突變體小孢子母細胞細胞壁的成分發生了變化.在花藥發育的第7期，野生型藥室中的四分體不僅四周包裹的胼胝質壁發出較強的黃綠色熒光，而且小孢子之間新生的分隔帶也發出屬于胼胝質的強烈黃綠色熒光，如圖2（b）所示.而盡管小孢子之間新生的分隔帶發出微弱的黃綠色熒光，spot1-3突變體藥室內的包裹四分體的細胞壁發出的是偏藍色的熒光，如圖2（f）所示.在花藥發育的第11期，二核花粉會在質膜和花粉外壁之間形成以纖維素為主要結構成分的內壁.由于纖維素有自發熒光，所以在野生型第11期以后的藥室里，在紫外光激發下可以看到有一個藍色的圓環圍繞在花粉粒的四周，如圖2（c），2（d）所示.與此相對應地，spot1-3突變體同期的藥室里沒有藍色圓環圍繞花粉粒，如圖2（g），2（h），圖3（f）所示;成熟的spot1-1突變體花粉粒外壁之內雖有藍色熒光，如圖3（g）所示，但比野生型的弱得多;成熟的spot1-2突變體花粉粒外壁之內的熒光偏黃綠色，類似胼胝質發出的熒光.上述結果表明：SPOT1功能的缺失使突變體雄配子細胞壁中胼胝質和纖維素等結構成分的合成發生異常，表現為小孢子母細胞時期胼胝質合成減少，纖維素合成增多，而二核花粉期后，內壁纖維素合成顯著減少，胼胝質合成可能增加.因此，spot1突變體花粉外壁孢粉素沉積異?？赡苁浅跎獗诮Y構異常的結果，而花粉外形皺縮是由于缺乏花粉內壁纖維素的支撐.

2.4 spot1突變體對茉莉酮酸刺激無應答

植物激素JA和乙烯（ET）可協同調控植物防御和器官發育，兩者之間還存在拮抗作用，表型之一就是乙烯利促進避光生長的種苗形成頂端彎鉤，而JA抑制這一過程.依據spot-1突變體因花絲伸長不足造成結實率顯著下降的現象，推測SPOT-1蛋白的功能可能與茉莉酮酸信號傳導有關.將野生型和spot1春化后的種子播種在不同基質的1/2 MS培養基上避光生長3 d，3日齡黃化幼苗的頂鉤彎曲度如圖4所示，統計分析結果如表2所示.

由圖4和表2可知：在正常生長條件下（1/2 MS培養基），3日齡黃化spot1-3幼苗的頂鉤彎曲度[（179±7）°]顯著大于3日齡黃化野生型幼苗的頂鉤彎曲度[（140±14）°].在1×10-6乙烯利處理下，3日齡黃化spot1-3幼苗與黃化野生型幼苗一樣形成夸張的頂端彎曲，彎曲度分別為 （350±8）° 和 （345±7）°，兩者沒有顯著性差異.在10 μmol·L-1 JA處理下，3日齡黃化野生型幼苗的頂鉤彎曲度受到抑制，為 （83±16）°，而3日齡黃化spot1-3幼苗的頂鉤彎曲度不受影響，為 （164±22）°.在1×10-6乙烯利和10 μmol·L-1 JA同時存在的條件下，JA抑制了乙烯促進黃化野生型幼苗頂鉤形成的作用，其彎曲度為 （170±8）°，但JA不能抑制乙烯促進黃化spot1-3幼苗頂鉤形成的作用，其彎曲度為 （348±9）°.上述結果表明spot1-3突變體對外源乙烯刺激的反應能力正常，但失去了對內源和外源JA刺激的反應能力，提示SPOT1蛋白可能是茉莉酮酸信號傳導途徑的關鍵成分之一.

3 討 論

根據SPOT1基因的突變會影響花粉外壁紋理形成的研究報道[18]，首先利用SEM技術觀察花粉外貌，再結合T-DNA插入位點鑒定及T-DNA旁臨序列分析等技術，獲得了3個獨立的SPOT1基因功能缺失株系spot1-1，spot1-2和spot1-3，再次證實SPOT1確實參與花粉外壁紋理的形成.

研究結果表明：SPOT1功能缺失突變體spot1失去了對內源性和外源性茉莉酮酸的反應能力，改變了小孢子母細胞細胞壁、四分體時期小孢子初生外壁和花粉內壁的結構成分，使花絲伸長與柱頭發育不協調，造成了spot1成熟花粉外壁結構缺陷，內壁缺乏纖維素剛性支撐而皺縮，以及果莢中種子數量顯著下降等結果.本研究結果為進一步從分子水平研究SPOT1的作用機制提供了參考.

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（責任編輯：顧浩然）