呼吸道合胞病毒非結構蛋白1感染對A549細胞let-7c-5p及miR-122-5p表達的影響

曾冬新 馮淑文 王壽懿 趙東赤

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是兒童感染最常見的病原體，大多數嬰兒在出生后兩年內至少感染一次RSV，導致每年約300萬患兒住院治療和11.8萬 5歲以下的兒童死亡［1，2］。RSV感染主要局限在呼吸道，病毒復制引起炎癥細胞的聚集，釋放炎癥因子，導致氣道平滑肌水腫，氣道阻塞，氣道高反應性，臨床表現為毛細支氣管炎及喘息［3-4］。RSV基因組由單股副鏈RNA組成，全長約15 KB，包含10個編碼區(qū)，共編碼11種蛋白。非結構蛋白NS1蛋白基因組全長531 bp，共編碼139個氨基酸，分子量為（17.5±2.1）KD［5］。NS1是抑制宿主產生抗病毒反應的主要成分：通過激活 NF-κB及磷酸化蛋白激酶AKT、抑制腫瘤壞死因子、上調抗凋亡基因bcl-2、下調凋亡基因bax等途徑抑制細胞凋亡來促進病毒復制［6，7］；抑制Ⅰ型干擾素的作用，拮抗宿主天然免疫反應，抑制T淋巴細胞的增殖及作用，拮抗宿主獲得性免疫應答［8，9］。由于缺乏經驗證的安全有效的疫苗及抗病毒藥物，RSV依然是人類健康所面臨的重要挑戰(zhàn)，了解病毒蛋白對宿主的抗病毒反應的機制對制定新的抗病毒干預措施是至關重要的。

微小RNA（microRNAs/miRNAs）是一種小分子的非編碼RNA，成熟的miRNAs長度大約為20個核苷酸，它通過與目的基因的3′端非編碼區(qū)，或目的信使RNA的5′端非編碼區(qū)結合調節(jié)基因轉錄后的表達，最終抑制信使RNA的轉錄或使之降解，在基因轉錄水平上調節(jié)蛋白質的表達［10，11］。miRNA參與了感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展，甚至由此引起相關腫瘤疾病。病原體感染后可引起機體一系列的變化，譬如，病毒可以通過宿主miRNA來調節(jié)病毒周期及宿主細胞的內壞境，以利于其生存；宿主的miRNA也可以反過來調節(jié)病毒基因的表達。研究證實，RSV通過調節(jié)宿主miRNA的表達來影響宿主抗病毒免疫應答［12］。我們前期通過基因芯片研究了RSV感染兒童外周血miRNAs表達的變化，篩選出表達具有顯著差異的miRNAs，包括 miR-106b-5p，miR-20b-5p，miR-342-3p，miR-877-5p，miR-122-5p，miR-320d和 let-7c-5p，其中以let-7c-5p及miR-122-5p表達差異性最為明顯［13］。本研究通過進一步的體外實驗，通過向A549細胞轉染呼吸道合胞病毒非結構蛋白NS1重組質粒（pNS1）來構建體外NS1感染模型，進一步明確NS1對宿主let-7c-5p及miR-122-5p的調節(jié)，了解病毒跟宿主相互作用，為臨床治療RSV感染提供更多的依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器 人肺腺癌細胞A549由武漢大學中南醫(yī)院醫(yī)學科學研究中心保存，RSV NS1重組質粒（pNS1-flag）由本實驗室保存，高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（Sepro），RNA提取液（Servicebio），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒（Thermo），FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量 PCR試劑盒（Roche），ViaFectTM Transfection Reagent轉染試劑（Promega）。三氣培養(yǎng)箱（Panasonic，MCO-170MUVL），倒置顯微鏡（Olympus，IX73），生物安全柜（Thermo Fisher，1300系列A2），全自動細胞計數儀（invitrogen，CountessTM II FL），實時熒光定量 PCR儀（Bio-Red，CFX ConnectTM）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) A549細胞使用10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素/鏈霉素）+高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至90%融合時用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化進行傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2NS1重組質粒/空載質粒轉染A549 12孔板每孔轉染1 ug DNA，DNA：ViaFectTMTransfection Reagent=1μg：3μl。NS1重組質粒組（pNS1組）轉染NS1重組質粒，空載質粒組（vector組）轉染空載質粒。前一天以5×105個/孔的密度將A549細胞接種于12孔板中，使用10%胎牛血清無雙抗DMEM培養(yǎng)基，待細胞生長至90%融合時進行進行轉染。操作按照ViaFectTMTransfection Reagent說明書進行，轉染24 h及72 h后收集細胞。

1.2.3qRT-PCR檢測miRNAs表達 收集各組細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，nanodrop2000測量RNA濃度及純度。以1μg總RNA為模板，采用莖環(huán)法合成cDNA第一鏈，以1μL cDNA第一鏈為模板，10 μmol/L的miRNA通用檢測引物和miRNA特異性反應引物各 0.5μL，FastStart Universal SYBR Green Master10μl，去核酸酶水8μL，用qPCR反應擴增目的基因let-7c-5p、miR-122-5p，用 GAPDH作為內參基因，反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min擴增40個循環(huán)，融合曲線分析60℃到95℃。各組數據與GAPDH進行相對定量后均與相應時段的對照組進行統計比較分析，每組實驗均重復3次。qRTPCR所用引物見表1。

1.3統計學分析 采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 qRT-PCR所需的引物序列

2 結果

2.1miRNAs的異常表達 pNS1或空載質粒轉染A549細胞24及72 h后提取總RNA進行qRT-PCR檢測，結果提示，pNS1感染后24 h較空載質粒組let-7c-5p的表達增高，而miR-122-5p的表達則降低，72 h較24 h時作用效果更明顯（見圖1）。

2.2靶基因預測 采用下列10種生物信息學軟件預測 靶 基：DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan，進行l(wèi)et-7c-5p及miR-122b-5p的靶基因預測，上述10個靶基因預測軟件中交集最高的部分預測靶基因見表2、3。

圖1 miRNAs的異常表達

表2 let-7c-5p的部分預測靶基因

表3 let-7c-5p的部分預測靶基因

2.3預測靶基因GO功能富集 選取上述10個靶基因預測軟件中l(wèi)et-7c-5p及miR-122b-5p的預測靶基因中交集最高的前3000個靶基因進一步進行GO生物學過程功能富集。結果顯示，let-7c-5p生物學過程功能富集于離子輸運的正調節(jié)、嘧啶核苷酸合成及代謝過程、亮氨酸代謝過程、DNA分解過程、調節(jié)淋巴細胞凋亡；miR-122b-5p生物學過程功能富集于正向調控趨化、蛋白質氨基酸糖基化、磷酸代謝過程、核質運輸的正調控、對外部刺激反應的正向調節(jié)、轉錄、正向調節(jié)細胞因子的產生、RNA代謝過程的調節(jié)。見表4、5。

2.4預測靶基因功能分析 選取上述10個靶基因預測軟件中l(wèi)et-7c-5p及miR-122b-5p的預測靶基因中交集最高的前3000個靶基因進一步進行KEGG信號通路分析。結果顯示，let-7c-5p的信號轉導通路主要富集于嘧啶代謝；miR-122b-5p靶基因集合的信號轉導通路主要富集于內吞作用、黏著斑、白細胞遷移、腫瘤信號通路、硫酸角質素生物合成、凋亡、MAPK信號通路。見表6、7。

表4 let-7c-5p預測靶基因的生物學過程

表5 miR-122-5p預測靶基因的生物學過程

3 討論

我們通過實驗證實NS1感染A549細胞可上調let-7c-5p、下調miR-122-5p的表達，與此前研究的RSV感染兒童外周血中l(wèi)et-7c-5p、miR-122-5p均下調不太一致，其原因可能是因為外周血中l(wèi)et-7c-5p、miR-122-5p的水平是人體綜合作用的結果，與機體的反饋及負反饋息息相關。RSV感染可觸發(fā)宿主的天然免疫反應，導致宿主細胞死亡：通過誘導肺上皮細胞、巨噬細胞產生TGF-β，激活TGF-β依賴的SMAD-2/3信號通路，促進自噬作用［14］；通過激活 NF-κB、JAK/STAT信號通路促進趨化因子及炎癥因子的產生、募集固有免疫細胞拮抗病毒［15］；晚期則通過TGF-β信號通路誘導Th17細胞、Th9細胞和CD4 CTL樣效應細胞來增強適應性免疫應答［16］。RSV非結構蛋白NS1則通過PI3K激活ATK，AKT直接磷酸化使調亡相關因子BAD及Caspase失活，激活NF-κB等途徑抑制細胞調亡，miR-122-5p參與此過程。NS1還可蛋白抑制Th1細胞和Th17細胞的增殖和活化，促進Th2的增值和活化［17］，該過程涉及T細胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路和MAPK信號通路，是RSV感染導致慢性氣道炎癥的病理基礎，miR-122-5p參與此過程。let-7c-5p的預測靶基因ABCB9編碼的膜相關蛋白是ATP結合盒轉運蛋白超家族的成員，參與抗原的提呈［18］；BAX基因編碼的蛋白屬于BCL2蛋白家族，其作為抗或促凋亡的調節(jié)因子參與多種細胞活動［19］；IL2、IL3基因編碼的蛋白質是一種強有力的促生長細胞因子，參與細胞生長、分化、凋亡等多種細胞活動。RSV感染所致的細支氣管炎兒童的肺泡灌洗液中IL3異常增高，其水平與患兒以后生活中反復喘息的發(fā)展直接相關［20］。RSV感染導致的喘息發(fā)病機制假說中，RSV感染作為誘發(fā)因素，通過miRNA增加炎性介質的合成以及提高氣道平滑肌白三烯合成酶活性及白三烯受體表達量，增強呼吸道平滑肌對炎性介質的反應強度，并通過miRNAs外泌體調節(jié)胸腺淋巴細胞的分化和功能改變，上調Th2樣細胞分化，抑制免疫耐受，提高機體對過敏原的敏感性［21］。結合let-7c-5p生物學過程功能富集于離子輸運的正調節(jié)、嘧啶核苷酸合成及代謝過程、亮氨酸代謝過程、DNA分解過程、調節(jié)淋巴細胞凋亡，miR-122b-5p信號通路富集于內吞作用、黏著斑、白細胞遷移、調亡、MAPK信號通路，我們猜測RSV感染后通過NS1上調let-7c-5p，下調miR-122-5p的表達來抑制細胞凋亡，逃逸細胞免疫應答，促進病毒復制，細胞因子釋放產生，氣道平滑肌反應性增高，引起喘息及慢性氣道炎。

miRNAs在RSV感染后的氣道高反應性形成中發(fā)揮重要作用，參與調控炎性程序、免疫細胞分化及功能、以及誘導免疫耐受下降，可能成為與RSV感染相關的兒童喘息及氣道炎的潛在預防和治療靶點。在本實驗中，我們只選取了2個miRNA進行實驗及功能分析，結果多集中于let-7c-5p及miR-122-5p可能抑制宿主細胞的凋亡，抑制先天性或獲得性免疫應答，有利于病毒增殖及有助于受感染細胞長期持續(xù)表達。然而，實際上miRNA是一個動態(tài)調節(jié)網絡，每個上調表達或下調表達的miRNA都可能觸發(fā)其他功能相似或相反的miRNA的表達變化。因此，進一步miRNA的特異性干預實驗還有待進行。