維生素D水平及其受體基因的多態(tài)性與女童中樞性性早熟關(guān)系的研究

鐘龍青 ，劉志強 ，楊利 ，劉發(fā)娣 ，柯江維

(江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

維生素D(Vit D)又稱為骨化醇、抗佝僂病維生 素，是不同的Vit D原經(jīng)紫線外照射后形成的脂溶性固醇類衍生物,也是一種類固醇激素[1],并由細胞內(nèi)特異的Vit D受體(VDR)介導(dǎo)，發(fā)揮激素樣的生理特性。維生素D受體是介導(dǎo)有生物活性的維生素D發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，屬于類固醇激素受體，其功能反映了活性維生素D的功能[2,3]。同時，研究發(fā)現(xiàn) VDR 基因 ApaI， TaqI， BsmI和FokI的多態(tài)性與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)[4-6]。

Vit D與性激素（主要指雌二醇）同屬于類固醇激素，兩者之間是否具有交叉的生物學(xué)效應(yīng)。目前尚無文獻報道。國外已有少數(shù)的文獻研究表明，VDR介導(dǎo)的Vit D信號途徑參與了兒童性腺的發(fā)育，Vit D水平及VDR基因可能與兒童性激素的分泌及性早熟有著密切的關(guān)聯(lián)，但沒有Vit D水平及VDR基因多態(tài)性與兒童性早熟相關(guān)性的研究。因此，本文將研究中樞性性早熟女童Vit D濃度變化及VDR基因多態(tài)性差異，以了解維生素D影響女童性早熟的部分機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象及標本采集 選取2016年7月-201 6年9月期間在我院內(nèi)分泌科住院或門診就診的臨床癥狀符合且經(jīng)B超，骨齡攝片，CT，MRI及GnRHa激發(fā)試驗確認為中樞性性早熟[7]，并排外其他疾病的40例省內(nèi)女童為病例組，年齡為7.90±0.67歲，并選取同期在我院兒保科進行體檢且身體健康的女童作為對照組，年齡為7.86±1.25歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集 留取病例組與對照組患兒外周血4ml,其中2ml置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，另外2ml置于普通管中，立即送檢，用化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測其血清25-OH Vit D的濃度。

1.2.2 外周血基因組DNA提取 將置于EDTA抗凝管中的2ml血,采用TIANGEN試劑盒提取DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計與合成 委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合設(shè)計合成。

1.2.4 rs2228570，rs7975232，rs1544410，rs731236目的基因的擴增和多態(tài)性位點測序 先采用多重PCR進行擴增,之后進行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)并將延伸產(chǎn)物純化后在ABI3730XL測序儀上測序,采用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用spss17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,基因型和等位基因頻率采用基因計數(shù)法計數(shù),研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四方格χ2檢驗,計量資料維生素D進行正態(tài)性檢驗，其呈偏態(tài)分布,采用秩和檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例基本資料 該實驗納入中樞性性早熟女童40例，年齡(7.90±0.67)歲，正常健康女童40例，年齡(7.86±1.25)歲,兩組年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.190，P=0.85)。

2.2 病例組和對照組血清中VitD測定 中樞性早熟患兒25-OH Vit D水平為 45.51(35.06，54.24)nmol/L,健康兒童25-OH Vit D水平為60.25(52.19，72.95)nmol/L，將其進行秩和檢驗發(fā)現(xiàn)兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 中樞性性早熟和健康對照組25-OH Vit D水平

2.3 中樞性早熟患兒的發(fā)育年齡與血清中維生素D的水平進行相關(guān)性分析 發(fā)現(xiàn)中樞性早熟患兒的發(fā)育年齡與血清中維生素D的水平兩者之間無線性關(guān)系（P=0.561）。

2.4 中樞性性早熟和健康對照組25-OH Vit D各水平構(gòu)成比 40例中樞性性早熟患兒中，有13例(32.5%)出現(xiàn)維生素D缺乏，13例(32.5%)出現(xiàn)維生素 D 不足(25-OH Vit D<50 nmol/L)，14例（35%）的維生素D水平正常。在健康對照組中,維生素D不足者有7例（17.5%），33例（82.5%）維生素D水平正常。維生素D不足的女童患中樞性性早熟的風(fēng)險明顯提高（OR=8.755，95%可信區(qū)間為3.086~24.838）。 見表 2。

表2 中樞性性早熟和健康對照組25-OH Vit D各水平構(gòu)成比

2.5 VDR基因多態(tài)性位點測序結(jié)果 將所提取的DNA送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司用ABI 3730XL型測序儀進行SnapShot測序。測序所得VDR基因在兩組人群中的分布頻率,經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗,達到遺傳平衡,具有群體代表性。

2.6 兩組間VDR基因多態(tài)性的比較 基因序列rs1544410(BsmI)的野生型為 CC，突變型為 CT、TT，中樞性性早熟組與正常對照組均未檢測到TT，基因型CC、CT在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.721，P=0.396)。 兩組基因型 CC和 CT的 OR和95%可信區(qū)間(CI)分別為1.056(0.931-1.197)和0.500(0.097-2.577)。基因序列rs2228570(FokI)的野生型為AA，突變型為GA、GG，此三種基因型在中樞性性早熟和正常對照組的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.414，P=0.181)，等位基因 A、G 在兩組的分布差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.633，P=0.105)。 基因序列rs731236(TaqI)的野生型為AA，突變型為GA、GG，兩組均未檢測到GG，基因型AA、GA在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.000,P=1.000)。基因序列rs7975232(ApaI)的野生型為CC，突變型為CA、AA，三種基因型在兩組的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.833，P=0.007)。 等位基因 C、A 在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=2.795，P=0.095)。見表3。

表3 中樞性性早熟組和對照組VDR基因多態(tài)性的比較

3 討論

性早熟是一種兒童生長發(fā)育異常的疾病，與兒童的正常生長發(fā)育周期相違背,影響兒童的身心健康并引起一系列社會經(jīng)濟問題[8,9]。性早熟的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜,是基因和環(huán)境共同影響作用的結(jié)果。自2008年,維生素D缺乏或不足引起公共衛(wèi)生問題[10]被提出，維生素D逐漸成為人們研究的熱點。有研究表明維生素D可能與性早熟的發(fā)病有關(guān)。

目前有關(guān)維生素D與性早熟相關(guān)性的研究較少。國內(nèi)唐家彥[11]等研究表明性早熟女童維生素D水平明顯低于對照組女童。國外Hae Sang Lee[12]等研究表明性早熟女童中,維生素D缺乏者的比例明顯高于正常女童。本文對40例性早熟女童和40例健康女童進行研究發(fā)現(xiàn),中樞性性早熟女童維生素D水平低于健康女童,其維生素D不足者所占比例明顯高于正常對照組女童。中樞性性早熟女童中維生素D水平與其發(fā)育年齡進行相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)兩者間無相關(guān)性，與國內(nèi)外之前研究相符。

眾所周知，25-OH VitD必須通過與VDR結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。同時有研究表明維生素D代謝過程中所需的酶受VDR基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)[13,14]。新近的研究表明：VDR的功能受VDR基因SNP的影響，且與多種疾病相關(guān)，在VDR眾多SNP位點中，研究較多的是 ApaI(rs7975232)、BsmI(rs1544410)、TaqI（rs731236）、FokI(rs2228570)。

目前有關(guān)VDR基因多態(tài)性與性早熟的研究也較少，國外學(xué)者Santos BR[15]2012年對36名性早熟兒童進行研究發(fā)現(xiàn)，VDR的ApaI多態(tài)性位點可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)雌激素的分泌與性早熟的發(fā)生有關(guān)，具體作用機制沒有闡明。本文采用SnaPshot方法對VDR的SNP位點，包括ApaI(rs7975232)、BsmI(rs1544410)、TaqI（rs731236）、FokI(rs2228570)進行檢測分析。實驗中發(fā)現(xiàn)中樞性性早熟組以及健康對照組的 BsmI(rs1544410)和 TaqI（rs731236）位點僅能檢測到野生型與雜合型兩種基因型,分別為CC、CT和AA、GA。中樞性性早熟組的基因型以及分布頻率分別為 CC(95%)、CT(5%)和 AA(90%)、GA(10%)，對照組的為 CC(90%)、CT(10%)和 AA(90%)、GA(10%)，各基因型在兩組的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.721，P=0.396；χ2=0，P=1）。 等位基因 C、T和G、A在兩組中分布的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.693，P=0.405；Xχ2=0，P=1）， 提示這兩位點的多態(tài)性可能與性早熟的發(fā)病無關(guān)。FokI(rs2228570)位點在兩組中均存在三種基因型，中樞性性早熟組的基因型以及分布頻率分別為AA(12.5%)、GA(40%)、 GG(47.5%)， 對照組為 AA(17.5%)、 GA(55%)、GG(27.5%)，三種基因型在兩組的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.414，P=0.181）。 對 G、A 兩等位基因進行分析，發(fā)現(xiàn)其在兩組的分布差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.633，P=0.105）。提示多態(tài)性位點FokI可能與性早熟的發(fā)病無關(guān)。對于ApaI(rs7975 232)位點,兩組中均發(fā)現(xiàn)三種基因型 CC，CA，AA,其分布頻率分別為25%,70%,5%和55%,35%,10%,在兩組間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=9.833，P=0.007）。這說明VDR的ApaI位點的多態(tài)性存在可能影響了性早熟的易感性。

綜上所述，我們推測ApaI(rs7975232)位點的突變可能影響了VDR基因mRNA3’末端非翻譯區(qū)，該區(qū)通過調(diào)控VDR蛋白質(zhì)的合成，影響VDR蛋白的表達，從而影響患兒對性早熟的易感性。結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)維生素D水平影響性早熟的發(fā)病率，而維生素D的生物活性作用需要VDR介導(dǎo)，推測可能維生素D是通過影響VDR的ApaI位點的多態(tài)性起作用的。其作用機制值得進一步研究。