桂北地區惡性腫瘤患者外周血T淋巴細胞亞群和淋巴細胞亞群的相關性研究

周獻青 ，楊明 ，晏強 ，陳潔晶 ，戴勇 ，黃錦龍

(1.廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541004；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二四醫院腎臟科，全軍器官移植與透析治療中心，廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林 541002；3.暨南大學第二臨床醫學院，深圳市人民醫院臨床醫學研究中心，廣東 深圳 518020)

腫瘤疾病發展成為嚴重威脅人類生命健康和生存發展的重大因素,目前全世界的腫瘤發病率呈上升趨勢,廣西惡性腫瘤防治的重點癌癥疾病有肺癌，乳腺癌，鼻咽癌，宮頸癌等[1,2]。腫瘤的發生、發展及預后與機體的免疫狀態密切相關。在控制腫瘤細胞生長過程中，細胞免疫發揮重要作用，T細胞介導的特異性免疫尤為重要。T淋巴細胞可以反映人體細胞的免疫功能,是免疫系統的關鍵[3]。如惡性腫瘤、血液疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等[4]；非特異性免疫細胞也反映了腫瘤細胞的殺傷能力和巨噬細胞的殺菌活性。本研究就桂北地區（桂林市、賀州市）的四種常見惡性腫瘤（鼻咽癌，乳腺癌，宮頸癌和肺癌），通過流式細胞術分析184例癌癥患者的T淋巴細胞亞群和淋巴細胞亞群，討論患者的免疫狀態。

1 材料和方法

1.1 標本來源 選取桂北地區（桂林市、賀州市），中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二四醫院腫瘤科在2017年1月至12月收治腫瘤患者共184例，男性77例，女性107例，年齡區間在30～70歲，其中94例鼻咽癌，32例乳腺癌，36例宮頸癌，22例肺癌。所有病例均經過病理學明確診斷。同時選取40例健康體檢人員，作為正常對照組，符合性別年齡區間，排除近期有感染情況和其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 材料和試劑 采集腫瘤組和正常組的靜脈外周血2 ml于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）的抗凝管中，反復顛倒混合。T淋巴細胞亞群檢測試劑盒、淋巴細胞亞群檢測試劑盒、溶血素、熒光微球計數試劑（996/μl），試劑盒由美國 Beckman coulter Inc公司提供，嚴格按照說明書操作。

1.2.2 儀器 檢測儀器為Epics XL流式細胞儀，購自美國Beckman coulter Inc公司。

1.2.3 實驗過程 ⑴移液槍取50 μl外周血,5 μl抗體，振搖混勻,避光,置于 28°C 水浴鍋，15 min；⑵加入溶血素 300 μl,避光,置于 28℃水浴鍋,10 min；⑶檢測T淋巴細胞亞群上樣管中加入50 μl熒光微球試劑；⑷加入PBS磷酸緩沖液500 μl,上機，調取方案,檢測。

1.3 統計學處理 本研究采用SPSS17.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗分析。所有數據均具有統計學顯著性，平均值±標準差（）測試水平為 0.05（Sig雙邊）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T淋巴細胞亞群細胞絕對計數 CD3+T細胞與正常組的差異有統計學意義（P=0.000）有顯著性差異。正常組和腫瘤組CD4+T細胞的差異有統計學意義（P=0.000）。正常組和腫瘤組CD8+T細胞的差異有統計學意義（P=0.000）。鼻咽癌的CD4+/CD8+比值低于正常組，差異有統計學意義（P=0.000）.乳腺癌(P=0.634）、宮頸癌（P=0.409）、肺癌（P=0.629）較正常組高但差異無統計學意義。見表1。

2.2 淋巴細胞亞群相對計數 鼻咽癌組和正常組CD3+%（P=0.000），CD56+%（P=0.001）的比較差異具有統計學意義。 CD19+%（P=0.067）差異無統計學意義。 乳腺癌組與正常組對比，CD3+%（P=0.453）、CD56+%（P=0.371）、CD19+%（P=0.573）差異無統計學意義。與正常組比較，宮頸癌CD3+%（P=0.000）差異有統計學意義;CD56+%（P=0.094）CD19+%（P=0.235）差異無統計學意義。肺癌組與正常組對比，CD3+%（P=0.157）、CD56+%（P=0.287）、CD19+%（P=0.177）差異無統計學意義。見表2。

表1 T淋巴細胞亞群的絕對細胞計數

3 討論

人外周血淋巴細胞群由三種細胞組成：T細胞（來自胸腺），B細胞（來自骨髓）和NK細胞（自然殺傷細胞）在免疫系統的功能中起著核心作用。取決于它們的表型和功能，T細胞包括T淋巴細胞測定中的成熟 T細胞 （CD3+）、 輔助/誘導 T細胞（CD4+）、抑制/細胞毒 T 細胞（CD8+）[5]。 用抗原或巨噬細胞活化T淋巴細胞后，某些B細胞（CD19+）分化成產生和分泌特異性免疫球蛋白的漿細胞。NK細胞（CD56+）被認為是離散的細胞溶解受體，在調節細胞生成、保護機體免受病毒感染和消除惡性細胞方面發揮重要作用[6]。

表2 淋巴細胞亞群的相對計數

CD3+T細胞可以反映宿主細胞的免疫狀態。CD4+T細胞主要為輔助性淋巴細胞，具有免疫記憶功能和直接殺傷腫瘤細胞功能,可分泌多種免疫抑制因子，如IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ等,抑制腫瘤生長及轉移。本研究中,腫瘤組CD3+T細胞和CD4+T細胞值低于正常組,差異有統計學意義,與多位學者報道結果一致[7-10]。在癌癥患者中，受多種抑制因子的影響，機體處于免疫抑制狀態，導致抑制CD4+T細胞的分化和成熟。從而造成CD3+T細胞和CD4+T細胞的免疫功能低下。

CD8+T細胞可分化為細胞毒性T細胞（CTL），對細胞具有一定的殺傷作用，可抑制免疫應答，對細胞免疫進行負調節。在本研究中，腫瘤各組的CD8+T細胞低于正常組，差異有統計學意義。CD8+T細胞價值的變化更為復雜，學術界沒有統一的結果。李月亞等[3]認為肺癌患者CD8+T細胞比例顯著高于對照組。它表明肺癌免疫系統可以產生更多的CD8+T細胞并直接殺傷腫瘤細胞；但有學者[11]發現肺癌患者外周血CD8+T細胞比例下降，肺癌患者CD8+T細胞表面特異性受體結構發生改變。效應T細胞識別并結合靶標，反饋會導致CD8+T細胞比例下降，從而導致腫瘤細胞免疫逃離，CD8+T細胞比例下降。鄭惠源等[12]提出，鼻咽癌患者外周血淋巴細胞亞群治療前CD8+T細胞水平明顯高于正常對照組。而CD8+T細胞水平在治療后明顯下降。 梁新強等[13]在乳腺癌研究中，疾病組CD8+T細胞水平高于正常組，差異有統計學意義。其原因被認為是產生腫瘤衍生細胞因子的惡性腫瘤中惡性細胞的生長。譚秋梅認為[14]，在宮頸癌研究中，CD8+T細胞的水平顯著高于正常組。在司遠征的研究中，鼻竇炎患者的免疫功能處于失衡狀態，細胞的免疫功能出現損傷，患者的T淋巴細胞亞群各項結果均低于健康對照組[15]。

CD4+/CD8+比值是調節細胞免疫的重要部分，以維持免疫應答的相對平衡,并且是維持機體正常細胞免疫的重要因素。當自身免疫性疾病或腫瘤發生時，CD4+/CD8+比值下降，患者處于免疫抑制狀態[16]。本研究中鼻咽癌的CD4+/CD8+比值低于正常組，差異有統計學意義（P=0.000）。說明鼻咽癌患者細胞免疫功能降低，機體免疫功能失調。在治療之前，CD4+/CD8+比值較低,但在治療后不斷提高，表明患者的免疫功能有不同程度地恢復[12]。乳腺癌、宮頸癌、肺癌都略微高于正常組，但差異不明顯，無統計學意義，患者在臨床治療中是有效的，可以減少免疫抑制因子釋放腫瘤細胞,因此患者病情有所改善。在于鴻[17]提出的成果中，宮頸癌患者CD4+/CD8+比值與對照組比較差異無統計學意義，但是隨著患者臨床分型呈降低趨勢。

自然殺傷（NK）細胞來源于骨髓造血組織，屬于先天免疫系統,在人體免疫系統中起著重要作用。NK細胞的激活不需要抗原呈遞,也不需要MHC限制，獨立于抗體和快速激活[18]。NK細胞是體內重要的免疫細胞，短期內具有增殖力大、免疫調節、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老等特點，NK細胞不僅參與抗病毒感染，腫瘤和免疫調節，還參與某些情況下自身免疫性疾病的發生,受到普遍關注，臨床應用也顯示出巨大潛力和廣闊前景[19]。本研究中，鼻咽癌NK細胞相對計數（CD56+%）高于正常組，差異有統計學意義（P=0.001），討論可能與誘導鼻咽癌惡性細胞增殖產生的腫瘤衍生細胞因子有關。NK細胞相對計數（CD56+%）在乳腺癌中略低于正常組，但差異無統計學意義（P=0.371），猜測癌細胞未轉移，對免疫系統影響不大，與孫智[10]做出的結果相似。宮頸癌和肺癌中NK細胞相對計數（CD56+%）略高于正常組，但差異無統計學意義。

B細胞是具有初級體液免疫功能的淋巴細胞[20]。本研究中，腫瘤組與正常組之間差異無統計學意義。還需要結合患者藥物療法，免疫療法，輔助療法等進行進一步研究。章梁君等[21]認為，某些腫瘤患者的B細胞相對計數（CD19+%）與正常組對比差異無統計學意義，有可能說明在體液免疫中B細胞在惡性腫瘤疾病中影響較小。肺癌病人外周血流式檢測B細胞表面因子CD19+CD20-，結果顯示，在肺癌轉移患者高于未轉移患者，B細胞高表達抑制性分子；但是存在歸巢障礙,可能不能到達刺激淋巴器官，有效啟動體液免疫應答[22]。

綜上所述,流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群和淋巴細胞亞群是幫助診斷患者免疫功能是否正常的重要指標，在免疫監視、殺傷靶細胞和免疫調節等方面影響力較大。細胞免疫在腫瘤疾病的發展和治療中起著重要作用。T淋巴細胞亞群和淋巴細胞亞群檢測的細胞因子,在免疫過程中互相促進或者抑制,對患者機體免疫功能的失衡和抗腫瘤免疫起著重要的作用。使用流式細胞術檢測癌癥患的T淋巴細胞亞群和淋巴細胞亞群，評估患者的狀況，身體免疫情況實時監測、后期治療指導用藥具有一定的臨床應用價值。