寨卡病毒E、NS5蛋白生物信息學分析

鄒淑慧，李金亮，廖莎莎，張麗琴，劉聰

（贛州市人民醫院檢驗科，江西 贛州 341000）

至2015年5月以來，寨卡病毒 （Zika Virus，ZIKV）在美洲區域的傳播不斷升級，疫情逐步惡化，甚至有城市化和全球化傳播趨勢，對國際公共衛生造成嚴重威脅[1]。2016年2月，我國出現首例輸入性寨卡病毒感染，隨后國內陸續出現多例ZIKV感染病例，引起我國政府和衛生部門的廣泛關注[2]。

寨卡病毒屬黃病毒屬，為單股正鏈RNA，長約11kb，分為亞洲型和非洲型[3]，在系統發生樹上與同為黃病毒屬的登革熱病毒、Spondweni病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒非常相近[4]。寨卡病毒基因編碼多聚蛋白，包括病毒衣殼蛋白C，膜前體蛋白PrM，包膜蛋白 E和7個非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。 E 蛋白是病毒表面的主要蛋白，參與調節結合以及膜融合等方面。非結構蛋白中的NS5是病毒中最大的蛋白，含有RNA-依賴RNA聚合酶和甲基轉移酶，負責病毒基因組RNA的合成及加帽[5,6]。本研究將從生物信息的角度分析ZIKV E蛋白和 NS5蛋白序列特征，為進一步挖掘其基因信息，研究其致病機制提供分子依據，從而預防和控制寨卡病毒的感染與流行。

1 材料和方法

1.1 序列來源 所有病毒株E和NS5核苷酸、氨基酸序列均來源于GenBank中已登記的黃病毒屬相關參考序列。

1.2 ZIKV E、NS5核苷酸與氨基酸同源性比較 用Clustal X和Bioedit軟件對ZIKV不同地理株系及同屬成員的E、NS5基因及編碼蛋白序列進行比對，計算核苷酸與氨基酸同源性。

1.3 ZIKV E、NS5蛋白二級結構分析 選取中國首例分離的ZIKV基因組序列（登陸號：KU744693.1）為研究對象[2]，獲取E、NS5基因及氨基酸序列。通過蛋白結構在線預測網站Predict Protein Server（https：//www.predictprotein.org/）分析 E、NS5 蛋白的二級結構，對E、NS5蛋白的氨基酸組成以及蛋白序列可能存在的蛋白結合區、α螺旋區、β折疊區以及卷曲結構區域進行分析，同時預測蛋白結構中可能的暴露區域和隱藏區域。

1.4 ZIKV E、NS5蛋白的跨膜區結構分析 利用在線 軟 件 TMHMM v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對E、NS5蛋白氨基酸序列進行跨膜拓撲結構的預測，從而分析跨膜段、膜內段和膜外段的氨基酸序列。

1.5 ZIKV E、NS5蛋白的信號肽分析 應用Anthe-Pro軟件分析E、NS5蛋白氨基酸序列中可能存在的潛在信號肽結構。

1.6 ZIKV E、NS5蛋白B細胞抗原表位的預測 運用 Bepipred（http：//tools.iedb.org/bcell/）在線服務器程序預測E、NS5蛋白中可能的B細胞線性表位，得分大于0.350（軟件默認值）則預測為優勢線性B表位。

2 結果

2.1 ZIKV E、NS5核苷酸與氨基酸同源性分析 通過比較ZIKV不同地理株系及同屬成員的E、NS5蛋白核苷酸和氨基酸的同源性，結果顯示不同地理株的ZIKV E蛋白核苷酸和氨基酸同源性分別為87.1%～100%和94.2%～100%，跟同黃病毒屬其他成員比較，發現與Spondweni病毒更接近，氨基酸同源性最高達72.8%（表1）。不同地理株的ZIKV NS5蛋白核苷酸和氨基酸同源性分別為88%～99.9%和95.5%～100%，跟同黃病毒屬其他成員比較，也是與Spondweni病毒更接近，氨基酸同源性最高達77.5%（表2）。

2.2 ZIKV E、NS5蛋白二級結構 E蛋白編碼504個氨基酸，可能的蛋白結合位點有14個，主要位于 1～13、55～161、232～394aa 區段；α 螺旋區主要集中在 406～418、436～501aa區段，占 15.28%；β 折疊片主要在 2～73、91～143、165～216、236～401aa 區段，占33.93%；無規則卷曲占50.79%；此外，在蛋白中還可能包含兩個跨膜結構區域 （461～479aa、483～501aa）。整個蛋白暴露區域和隱藏區域均勻相間分布，見圖1。NS5蛋白編碼903個氨基酸，可能的蛋白結合位點有22個，主要位于6～119、247～418、518～744、895～899aa 區段；多聚核苷酸結合位點有兩個，位于741aa和856aa；α螺旋區主要集中在 2 ～67、158 ～288、350 ～444、545 ～575、611 ～627、753～888aa區段，占36.88%；β折疊片主要在74～146、578～606、702～743aa 區段，占 11.52%；無規則卷曲占51.60%；整個蛋白暴露區域和隱藏區域均勻相間分布，見圖1。

2.3 ZIKV E、NS5蛋白的跨膜區結構 TMHMM預測E蛋白有兩個跨膜區域，分別為455～477aa、484～503aa，膜外區域為 1～454aa，膜內區域為 478～483aa，見圖2。整個NS5蛋白均位于膜外，無跨膜區域，見圖3。

2.4 ZIKV E、NS5蛋白的信號肽 E和NS5蛋白均存在潛在信號肽結構，其信號肽斷裂位點分別位于 501aa 和 152aa，見圖 4、圖 5。

2.3 ZIKV E、NS5蛋白的B細胞抗原表位 運用Bepipred法預測B細胞線性表位，結果顯示E蛋白平均抗原性指數為0.062，分子內有多個可能的抗原表位區域。其中分值最高的表位區域為317～342aa，分值達1.919（閾值0.350）；其次為155～181、66～89、226～238、380～384aa （按分值高低排列），見圖6。NS5蛋白平均抗原性指數為0.107，分值最高表位區域為100～114aa，分值達2.297；其次為 360～372、148～159、688～707aa，見圖 7。

表1 E蛋白核苷酸和氨基酸的同源性比較

表2 NS5蛋白核苷酸和氨基酸的同源性比較

圖1 E蛋白二級結構（1A）及組成成分（1B）、NS5蛋白的二級結構（1C）及組成成分（1D）

圖2 E蛋白跨膜區域預測

圖3 NS5蛋白跨膜區域預測

圖4 E蛋白信號肽結構預測

圖5 NS5蛋白信號肽結構預測

3 討論

ZIKV屬于黃病毒科黃病毒屬的一種蟲媒病毒，且是一種人獸共患病毒。寨卡病毒可引起嚴重的神經系統損害，包括格林巴利綜合征（GBS）及新生兒小頭畸形，已經成為威脅全球人類健康的潛在因素[7]。目前尚無針對性的預防性疫苗和治療性藥物，因此開發相關疫苗迫在眉睫。

圖6 Bepipred工具預測E蛋白的線性B細胞表位

圖7 Bepipred工具預測NS5蛋白的線性B細胞表位

在基因組和蛋白質組學時代，基于疫苗開發、單克隆抗體的制備以及快速檢測試劑盒的研制，運用生物信息學工具分析蛋白質序列已成為蛋白質研究的重要手段[8]。本文通過生物信息學分析發現不同地理株系的ZIKV E蛋白和NS5蛋白同源性都比較高，提示這兩段序列比較保守。跟同黃病毒屬其他成員比較，顯示與Spondweni病毒關系最近，但同源性也僅有70%多。說明ZIKV雖然與其他黃病毒發病癥狀相似，但可能已經發展出不同的致病機制。

蛋白質的二級結構對抗原表位影響很大，α螺旋、β折疊的化學鍵鍵能較高，成為蛋白質中心的“支架”，很難與合適的抗體嵌合，而β轉角和無規則卷曲常位于分子表面，利于抗體結合，成為抗原表位的可能。本研究通過Predict Protein Server分析發現ZIKV E蛋白和NS5蛋白二級結構中無規則卷曲含量最高，分別占50.79%和51.60%，推斷這些區域與B細胞表位有關。另外E蛋白和NS5蛋白中還包含有多個可能的蛋白質相互作用位點，提示可能參與多種蛋白或者其他分子之間的相互作用并在ZIKV感染過程中發揮重要作用，可對這些相關功能位點進行深入研究，進一步揭示ZIKV的浸染機制。外膜蛋白通過加強巨噬細胞對抗原的攝取，增強淋巴細胞活化，在免疫反應中表現出重要作用，常作為保護性疫苗候選抗原。跨膜區域預測分析結果顯示E蛋白有兩個跨膜區域，其中氨基酸1～454位于膜外，而NS5均位于膜外。研究表明抗原表位可能不在這兩個跨膜域中[9]。在跨膜蛋白的N端，有一段疏水性氨基酸序列，稱為信號肽，新合成的蛋白質通過該信號肽進入正常的分選途徑。軟件分析表明E蛋白和NS5蛋白含有信號肽，為分泌性蛋白。

抗原優勢表位的確定是疫苗研制和臨床應用的基礎。運用生物信息學方法預測蛋白質的抗原優勢表位，并通過體外合成肽段進行實驗驗證，已廣泛應用于蛋白質抗原表位的鑒定[10]。Bepipred方法是結合線性B細胞表位預測的一種經典算法。本研究通過該方法預測發現，ZIKV E蛋白平均抗原性指數為0.062，分子內有多個可能的抗原表位區域， 如：317～342aa、155～181、66～89、226～238、380～384aa。NS5蛋白平均抗原性指數為0.107，可能的表位區域有 100～114aa，、360～372、148～159、688～707aa。對于進一步確認E、NS5蛋白的優勢表位信息，需要通過體外試驗、動物模型等來進行驗證。本研究預測的相關線性表位將為進一步E、NS5蛋白抗原表位的確證及診療抗體的開發提供一定的參考依據。

總之，本研究對ZIKV E蛋白和NS5蛋白的生物信息學分析，成功預測到其基本的結構特征和潛在的線性B細胞表位。這將有助于對E、NS5蛋白的深入研究奠定理論基礎，為開發ZIKV快速檢測的膠體金試劑盒和治療性抗體提供研究基礎。