尿液脫落細胞UCA1在前列腺癌的表達及臨床意義

沈菁，林有東，陳雯，林志坤，黃毅

(福建醫(yī)科大學省立臨床學院檢驗科，福建 福州 350001)

前列腺癌是歐美國家男性發(fā)病率排名第一的惡性腫瘤，在我國，其發(fā)病率也呈明顯上升趨勢，嚴重威脅我國老年男性的健康[1,2]。目前，臨床上常用直腸指診、血清中前列腺特異性抗原（PSA）、MRI作為前列腺疾病篩查的常規(guī)方法。直腸指診是一種簡單的檢查方法，但單用直腸指診的敏感度僅2%，且檢查結果與檢查者的經(jīng)驗有關。PSA檢測作為最常用的篩查手段，雖敏感度高，但因膀胱鏡檢、直腸超聲、前列腺按摩、前列腺梗死、前列腺炎以及前列腺增生等都會引起血清的PSA升高而導致診斷的特異性較低，造成過度診斷與治療[3]。MRI雖有良好的軟組織分辨力，能為前列腺癌的診斷和臨床分期提供重要依據(jù)，但當病灶體積較小、出血或受到良性疾病如良性增生結節(jié)、慢性炎癥及肉芽腫也會表現(xiàn)出低信號，降低了MRI診斷的特異性[4]。前列腺病理穿刺活檢雖是前列腺癌診斷的金標準，但穿刺活檢屬于有創(chuàng)檢查，患者的依從性差，且以PSA檢測為依據(jù)的前列腺穿刺活檢陽性率也較低，只有30%左右[5]。因此為提高診斷的準確性尋找并研究前列腺癌新的腫瘤標記物是必不可少的。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（LncRNA）可以直接對染色體組蛋白進行修飾，抑制或激活基因的轉錄，并在多種腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)失調，在多種生物過程中也具有多種功能[6,7]。UCA1尿路上皮癌相關抗原1(非蛋白質編碼)，最早在發(fā)現(xiàn)膀胱癌表達增高[8]，在細胞增殖中發(fā)揮作用。UCA1位于人類19號染色體p13位置上。在健康成人中，除心臟、脾臟外，UCA1在正常器官組織均沒有表達，而在人胚胎組織中卻較高表達[9]。目前國內外也已經(jīng)對UCA1與腫瘤的關系進行研究，在膀胱癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌等均發(fā)現(xiàn)UCA1表達的增高與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關系[10]。但UCA1在前列腺癌的臨床研究較少，本研究探討尿液脫落細胞中的UCA1定量檢測對前列腺癌的診斷價值，若可以提高前列腺癌診斷的準確性而且減少了前列腺穿刺活檢的侵入性檢查，是具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年9月-2018年2月初治泌尿外科住院60例男性患者尿液標本，其中前列腺癌患者30例，年齡（73±8）歲，前列腺增生患者30例，年齡（70±6）歲，均由病理穿刺活檢確診病例，另收集男性健康體檢者30例為對照組，年齡（68±6）歲。

1.2 標本 尿液標本采集晨尿10ml 3500r/min離心10min，倒干上清液后加入800μl TransZol UP試劑（北京全式金生物技術有限公司），水平靜置使裂解液充分裂解細胞后，使用移液槍反復吹吸至無明顯沉淀后，將細胞裂液轉移至EP管內，室溫靜置5min后放入-70℃超低溫冰箱中保存。

1.3 檢測方法

1.3.1 尿液脫落細胞RNA提取及逆轉錄 按照福州都拜特生物技術有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提取尿總RNA并用德國eppendenf公司核酸蛋白分析儀進行RNA濃度的檢測；根據(jù)EasyScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒 （北京全式金生物技術有限公司）說明書進行逆轉錄成cDNA。

1.3.2 RT-qPCR檢測UCA1采用Primer primer5.0與Primer-Blast軟件進行引物設計，引物由上海生物工程股份有限公司合成，UCA1正向引物：aag cct gat tgg gtg tct tct a，反向引物：gcc ttt gtg ccg cta ctt tta t；內參基因GAPDH正向引物：gga gcg aga tcc ctc caa aat， 反向引物：ggc tgt tgt cat act tct cat gg。按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，使用美國ABI公司實時熒光PCR儀，反應條件：首先94℃預變性30s，然后94℃變性5s，60℃退火、延伸31s，共完成45個循環(huán)，每個樣本復孔檢測。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 尿液脫落細胞UCA1相對表達量采用ΔΔCt法分析，以GAPDH基因作為內參基因，ΔCt=Ct（UCA1）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=Δ Ct（患者組）-ΔCt（對照組），UCA1 相對表達量即 2-ΔCt，通過 2-ΔΔCt計算UCA1在前列腺癌組與增生組患者中的相對表達差異。

1.4 統(tǒng)計分析 應用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，研究對象年齡組差異比較用T-test檢驗，兩組患者UCA1的相對表達量應用中位數(shù)及上下四分位數(shù)的形式表示，兩組比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線，計算曲線下面積(AUG)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象年齡比較 對前列腺癌組、前列腺增生組以及健康對照組的年齡差異進行統(tǒng)計學分析，結果顯示三組間的年齡分別為72.87±7.69歲、70.29±5.93 歲、以及 68.37±5.80 歲，三組間年齡差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；三組的年齡分組組成也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表 1。

表1 三組研究對象年齡比較

2.2 UCA1在前列腺癌和前列腺增生患者尿脫落細胞中的表達情況 以健康對照者尿脫落細胞UCA1的相對表達量為對照，計算前列腺癌與增生患者尿脫落細胞UCA1的相對表達差異，結果顯示前列腺癌患的表達量明顯高于前列腺增生患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者尿UCA1相對表達水平[中位數(shù)，(四分位數(shù))]

2.3 尿脫落細胞UCA1在前列腺癌中的診斷價值以前列腺增生組為參照，尿脫落細胞UCA1診斷前列腺癌的ROC曲線下面積 （AUC）為0.675（95%CI：0.514~0.836），約登指數(shù)最大值為 0.338時其診斷的敏感性為38.1%，特異性高達95.7%。見圖1。

圖1 尿脫落細胞UCA1診斷前列腺癌的ROC曲線

3 討論

前列腺癌是導致老年男性癌癥相關死亡的主要原因。由于早期檢測和診斷方法的改進以及更有效的治療策略，過去十年中與PC相關的死亡人數(shù)有所下降[11]，然而，由于不清楚潛在的分子機制，這種疾病的治療選擇有限，預后不良，更準確的預測生物標志物是國內外眾多學者致力鉆研的熱點與重點。真核基因組編碼許多長的非編碼RNA（lncrnas），這些長的非編碼RNA被定義為長度超過200個核苷酸的內源性細胞RNA，但缺少有效長度的開放閱讀框[12]。估計表明人類lncRNA的數(shù)量在10000到20000之間[13]。盡管有這么多的基因，但只有少數(shù)的lncRNA具有特征。大多數(shù)特征的lncRNA在癌細胞中表現(xiàn)出不受管制的表達，在癌細胞中發(fā)揮致癌或腫瘤抑制功能[12]。UCA1是最近發(fā)現(xiàn)的一種在各種類型的癌癥中異常表達的lncRNA。UCA1表達調控癌細胞增殖、遷移和侵襲[14]。Huang J等[15]報道，UCA1競爭性地抑制了hn-RNP對p27的抑制作用，從而顯著促進乳腺癌的增殖。Fan Y等[16]報道，UCA1通過以Wnt6依賴的方式激活Wnt信號，在膀胱癌的化療抵抗中起著重要作用，UCA1參與了PI3K途徑來調節(jié)細胞周期。然而，UCA1在前列腺癌發(fā)生和治療反應中的生物學作用和臨床意義尚不清楚。

在本研究中，我們用定量檢測前列腺癌和前列腺增生患者尿液脫落細胞UCA1的表達水平，結果表明，前列腺癌患者的尿UCA1表達顯著上調，明顯高于前列腺增生者 （P＜0.05）。這與Shilong Zhang等[17]研究的結果一致。Shilong Zhang等發(fā)現(xiàn)UCA1在PCA細胞系和組織樣本中顯著上調，UCA1高表達與高Gleason評分、晚期TNM分期和PCA患者總生存率較低呈正相關。Shilong Zhang還發(fā)現(xiàn)ATF2是UCA1的直接靶基因，UCA1作為一種競爭性的內源性RNA調控ATF2表達。UCA1還直接與miR-204相互作用，降低miR-204與ATF2 3'UTR的結合，進而抑制miR-204對ATF2 mRNA的降解，這些結果表明UCA1可能參與大多數(shù)人PC的發(fā)展、進展和預后。

為進一步判斷尿UCA1對前列腺癌的診斷效率，本研究以前列腺增生組為對照組，繪制ROC曲線，尿UCA1診斷前列腺癌的ROC曲線面積為0.675，診斷的敏感性僅38.1%，這可能由于尿液中脫落腫瘤細胞數(shù)量不夠造成。但其特異性高達95.7%，這有助于前列腺癌和增生患者的鑒別診斷。

中國前列腺癌診療指南（2014版）明確指出血清PSA作為前列腺癌的診斷指標，其受年齡影響。因此我們對研究對象病例的選擇也關注到了這個問題，對所選的年齡分組進行統(tǒng)計學分析，在檢驗水準P＜0.05條件下，研究對象的三個組別均沒有統(tǒng)計學差異，因此本研究排除了年齡這一變量的干擾。

綜上所述，UCA1基因在前列腺中的作用其潛在機制仍有待確定,但其在前列腺癌患者尿液脫落細胞中呈高表達水平，診斷特異性高，有助于前列腺癌和增生疾病的鑒別，UCA1可能是前列腺癌診斷的潛在生物標志物。