二甲雙胍對脂肪前體細胞增殖和分化的影響

車選強 宗琦 趙冉 趙淑淼

【摘要】 目的 研究不同濃度二甲雙胍對3T3-L1脂肪前體細胞的增殖和分化的影響。方法 將體外培養的3T3-L1脂肪前體細胞用不同濃度的二甲雙胍處理。分別采用倒置顯微鏡觀察細胞形態、MTT法、油紅0染色法、酶標儀測量光密度值等方法研究不同濃度二甲雙胍對3T3-L1脂肪前體細胞增殖、分化的影響。結果 在鏡下觀察3T3-L1脂肪前體細胞細胞貼壁后呈成纖維細胞樣， 當二甲雙胍組濃度較低（≤0.5 mmol/L）時， 其細胞的形態、密度、各組光密度值無明顯差異， 當二甲雙胍組濃度較高（≥5 mmol/L）時， 細胞出現變形、破壞， 甚至形成凋亡小體， 細胞數量也減少， 各組光密度值存在統計學差異。油紅0染色后顯微鏡下觀察細胞的形態， 陰性對照組細胞呈成橢圓形或梭形;陽性對照組、二甲雙胍濃度較低（≤0.5 mmol/L）組可見80%～90%的細胞向脂肪細胞分化， 細胞內見大量脂滴聚積， 油紅0染色明顯著色， 其光密度值與陰性對照組比較， 差異均有統計學意義（P<0.05）， 與陽性對照組比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）。二甲雙胍濃度為5 mmol/L組脂肪細胞表型數量、油紅0染色著色較對照組顯著減少， 其光密度值與陽性對照組比較， 差異有統計學意義（P<0.05）。結論 二甲雙胍濃度較低（≤0.5 mmol/L）時對3T3-L1脂肪前體細胞增殖無影響;二甲雙胍濃度較高（≥5 mmol/L）時3T3-L1脂肪前體細胞的增殖可明顯被抑制， 且隨著藥物的濃度增加抑制作用增強;二甲雙胍濃度較高（≥5 mmol/L）可能促進3T3-L1脂肪前體細胞的凋亡。低濃度的二甲雙胍（≤0.5 mmol/L）對3T3-L1脂肪前體細胞的分化無影響;3T3-L1脂肪前體細胞的分化可被5 mmol/L的二甲雙胍抑制。

【關鍵詞】 二甲雙胍;3T3-L1脂肪前體細胞;細胞增殖;細胞分化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.31.104

The effect of metformin on the proliferation and differentiation of preadipocyte ? CHE Xuan-qiang， ZONG Qi， ZHAO Ran， et al. Department of Endocrinology， Jinan 5th Peoples Hospital， Jinan 250022， China

【Abstract】 Objective ? To study the effect of metformin at different concentrations on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte. Methods ? 3T3-L1 preadipocyte cultured in vitro were processed with metformin at different concentrations. Cell morphology was observed by inverted microscope. The effects of metformin at different concentrations on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte was observed by MTT method， oil red O staining method， microplate reader measuring optical density value method. Results ? Microscopic observation of 3T3-L1 adipose precursor cells showed fibroblast-like appearance after adherence. When the concentration of metformin group was lower （≤0.5 mmol/L）， there was no significant difference in cell morphology， density and optical density between groups. When the concentration of metformin group was higher （≥5 mmol/L）， the cells were deformed， destroyed， even formed apoptotic bodies， and the number of cells decreased， and the optical density of each group had statistical difference. After oil red 0 staining， the cells in negative control group were oval or spindle-shaped. In positive control group and metformin group with lower concentration （≤0.5 mmol/L）， 80%～90% of the cells differentiated into adipocytes， and a large number of lipid droplets accumulated in the cells. Oil red 0 staining was obvious colored. Compared with the negative control group， the difference of optical density was statistically significant （P<0.05）， and there was no significant difference in optical density between the positive control group and the negative control group （P>0.05）. In metformin?5 mmol/L concentration group， the number of phenotypes and oil red 0 staining of adipocytes were significantly less than those of the control group. The optical density was statistically significant with the positive control group （P<0.05）. Conclusion ? Low metformin concentration （≤ 0.5 mmol/L） had no effect on the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte. The proliferation of 3T3-L1 preadipocyte was significantly inhibited when metformin concentration was higher （≥ 5 mmol/L）， and the inhibition increased with the increase of metformin concentration. Higher concentration of metformin （≥ 5 mmol/L） may promote apoptosis of 3T3-L1 preadipocyte. Low concentration of metformin （≤0.5 mmol/L） had no effect on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte. The differentiation of 3T3-L1 preadipocyte could be inhibited by 5 mmol/L metformin.

【Key words】 Metformin; 3T3-L1 preadipocyte; Cell proliferation; Cell differentiation

近年來隨著人類生活水平的提高及生活方式的轉變， 肥胖的發病率逐年增高， 并可引起嚴重的并發癥， 如2型糖尿病、高血壓病、呼吸睡眠暫停綜合征等[1]， 已經被世界衛生組織評定為危害人類健康的第5大因素[2]。在肥胖癥的發生、發展過程中脂肪組織起著重要的作用。研究證實， 脂肪前體細胞的增殖和分化與肥胖密切相關 [3]。脂肪前體細胞過多的分化及脂肪細胞的肥大均可誘導肥胖的發生[4]。脂肪前體細胞除分化外， 還可能面臨凋亡。二甲雙胍一直作為治療2型糖尿病的一線用藥， 除了具有降血糖作用以外， 還體現在心血管保護和減輕體重[5]， 改善胰島素抵抗方面。但是二甲雙胍能減輕體重的機制目前尚不明確。通過改變脂肪前體細胞的分化、凋亡而調節脂肪重新分配可能會改善腹型肥胖的問題[6]。二甲雙胍對脂肪前體細胞增殖、分化、凋亡有無影響， 目前報道較少。因此本實驗主要研究二甲雙胍對3T3-L1脂肪前體細胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 二甲雙胍購于中美上海施貴寶制藥有限公司;3T3-L1脂肪前體細胞購自于美國模式培養物集存庫;二甲基亞砜購于Amresco公司;DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium， DMEM）培養基、胎牛血清購于Hycolone公司;0.25%胰酶-EDTA（Ethylene Diaminetetraacetic Acid， EDTA）、雙抗、PBS（Phosphate Buffered Saline， PBS）緩沖液購于Gibco公司;牛胰島素、3-異丁基-1甲基黃嘌呤、地塞米松、油紅0、噻唑藍購于Sigma公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 細胞培養 第3代美國模式培養物集存庫的3T3-L1脂肪前體細胞（用25 cm培養瓶裝;高糖DMEM中含10%的胎牛血清、1%的雙抗）在溫度為37℃、飽和濕度5% CO2體積分數的培養箱中進行體外靜置培養， 當細胞生長至大約70%～80%融合時進行細胞傳代。

1. 2. 2 MTT法檢測細胞增殖 打開超凈工作臺， 將3T3-L1脂肪前體細胞鋪到96孔培養板中， 每孔加100 μl培養液， 細胞密度為5000個/孔。將接種細胞的42個孔共分為7組（每組6個副孔）。培養24 h當細胞融合約70%時， 實驗組加入0.05、0.5、5、10、20、50 mmol/L濃度的二甲雙胍， 實驗組換上含不同二甲雙胍濃度的基礎培養液， 對照組換上所加藥物等體積的PBS（二甲雙胍濃度為0 mmol/L）的基礎培養液， 培養48 h， 倒置顯微鏡下觀察細胞形態和數量。每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml， 即為0.5%MTT）， 繼續培養4 h后， 吸去孔內的培養液， 并在每孔中分別加入200 μl 的DMSO， 放置在恒溫振蕩器上振蕩10 min， 當看到結晶物質充分溶解。酶標儀測定在570 nm處的吸光度。

1. 2. 3 油紅O染色法檢測細胞分化 打開超凈工作臺， 把3T3-L1脂肪前體細胞鋪到24孔培養板中， 分別在每孔中加1 ml基礎培養液， 細胞密度為50000個/孔;設4個副孔;并設立陰性對照組（基礎培養液1 ml， 不加誘導液， PBS 50 μl， 無二甲雙胍）， 陽性對照組（誘導分化液Ⅰ1 ml， PBS 50 μl， 無二甲雙胍）， 實驗組（誘導分化液Ⅰ1 ml， 0.05、0.5、5 mmol/L濃度的二甲雙胍）， 當3T3-L1脂肪前體細胞誘導分化至第10～12天， 可見80%～90%的細胞分化成為脂肪細胞， 在顯微鏡下可觀察到明顯脂滴形成。吸去孔內的培養液， 用PBS清洗一次殘余培養液， 每孔加1 ml新鮮配制的油紅O工作液， 室溫作用10 min后棄去油紅0染料， 然后再用60%異丙醇漂洗1 min， 去除背景著色后放置在顯微鏡下仔細觀察脂滴形成。每孔分別加入200 μl 異丙醇， 放置于37℃作用10 min， 吸取脫色后的液體， 然后移入96孔板中， 酶標儀測定在510 nm處的吸光度。

1. 3 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用單因素方差分析進行組間均數比較， 兩兩進行比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 二甲雙胍以濃度依賴性抑制3T3-L1脂肪前體細胞的增殖 顯微鏡下觀察3T3-L1脂肪前體細胞貼壁后呈成纖維細胞樣， 在體外進行培養24 h后， 對照組， 0.05 mmol/L和0.5 mmol/L三組在顯微鏡下觀察， 細胞形態和細胞密度無明顯差異， 而5、10、20和50 mmol/L的二甲雙胍組和對照組相比， 顯微鏡下細胞形態明顯發生了改變（包括變形、破壞， 甚至形成凋亡小體）， 細胞的數量也顯著減少， 且破壞的程度隨著二甲雙胍濃度的增加而增加， 細胞數量也隨二甲雙胍濃度的增加而越少。繼續進行培養至72 h時， 亦呈上述結果。見圖1。用不同濃度的二甲雙胍對3T3-L1脂肪前體細胞的增殖過程干預72 h， 用MTT法在酶標儀570 nm處并測定各組的光密度值。結果發現對照組和0.05、0.5、5、10、20、50 mmol/L各組OD570的值分別為（2.13±0.14）、 （2.00±0.09）、（1.98±0.09）、（1.53±0.20）、（1.29±0.14）、（1.03±0.12）、（0.71±0.15）。3T3-L1脂肪前體細胞增殖受到明顯抑制， 且抑制效應呈濃度依賴性（P<0.01）;5、10、20和50 mmol/L不同濃度的二甲雙胍各組之間比較， 差異均具有統計學意義（P<0.05）， 二甲雙胍藥物濃度越增加， 其光密度值越小。見表1。

2. 2 二甲雙胍以濃度依賴性抑制3T3-L1脂肪前體細胞的分化 3T3-L1脂肪前體細胞接種到24孔培養板中誘導分化12 d， 并設立三組：陰性對照組、陽性對照組和實驗組， 在實驗組開始加誘導液時， 用不同濃度的二甲雙胍進行干預。結果①陰性對照組細胞未向脂肪細胞分化， 呈梭形或橢圓形， 用油紅0染色后著色不明顯。②陽性對照組中見80%～90%的向脂肪細胞分化， 可見脂滴， 用油紅0染色后著色明顯。③0.05 mmol/L二甲雙胍組和0.5 mmol/L二甲雙胍組亦可見80%～90%的細胞向脂肪細胞分化， 可見脂滴聚積， 用油紅0染色后著色明顯， 和陽性對照組無差別。④5 mmol/L的二甲雙胍組中向脂肪細胞分化的細胞數量和對照組相比明顯減少， 油紅0染色后著色也明顯減少。見圖2。當3T3-L1脂肪前體細胞被誘導分化12 d后， 應用油紅0染色法在酶標儀510 nm處測定各組光密度值。結果發現陰性對照組、陽性對照組及0.05、0.5、5 mmol/L各組OD510的值分別為（0.34±0.02）、（0.61±0.06）、（0.59±0.05）、（0.59±0.05）、（0.42±0.03）。發現與陰性對照組相比， 陽性對照組、含不同濃度二甲雙胍組的3T3-L1脂肪前體細胞分化受到明顯抑制， 且抑制效應呈濃度依賴性（P<0.01）。0.05、0.5 mmol/L二甲雙胍組和陽性對照組相比較， 差異均無統計學意義（P>0.05）， 而5 mmol/L二甲雙胍組和陽性對照組比較， 差異有統計學意義（P<0.01）;5 mmol/L二甲雙胍和0.05、0.5 mmol/L二甲雙胍組比較， 差異有統計學意義（P<0.01）。見表2。

3 討論

美國內分泌醫師協會將肥胖癥定性為一種疾病[7]， 肥胖癥已成為人們必須積極干預的健康問題。它會增加糖尿病、代謝綜合癥、心腦血管疾病的發生風險[8]。脂肪細胞的數量是由具有多向分化潛能的間充質干細胞在適當刺激下分化而成[9]。脂肪細胞的體積是由脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化的程度所決定的[10]。分化程度越高， 體積越大。因此脂肪細胞的異常增殖分化可引起肥胖。

二甲雙胍是目前臨床上應用最廣的降糖藥物， 其降糖的主要機制包括抑制肝臟葡萄糖的異生、促進糖原分解， 減少肝臟糖原的輸出， 抑制葡萄糖的吸收， 促進外周組織充分利用葡萄糖;改善組織對胰島素的敏感性并增加胰島素與外周組織中胰島素受體親和力[11]。抑制二肽基肽酶IV（DPP4）， 從而提高胰高血糖素樣肽（GLP-1）濃度[12]， 減少脂肪合成， 改善胰島素抵抗[13]。二甲雙胍對肥胖患者（無論其是否合并2型糖尿病）均有顯著的降低體重的作用[14， 15]， 但二甲雙胍減輕體重的作用機制目前尚不明確。因此本研究主要探究不同濃度二甲雙胍對脂肪前體細胞的影響。

二甲雙胍有減輕體重的作用， 但機制目前仍未完全闡明。可能的機制包括：①二甲雙胍通過改善瘦素和腫瘤壞死因子（TNF-α）的抵抗狀態[16]， 以抑制胞內的脂質積聚來延緩肥胖的發展。②二甲雙胍對食欲有抑制作用[17]， 從而達到減重作用。③改善高胰島素血癥并降低基礎胰島素及負荷后胰島素水平[17]。④二甲雙胍能抑制前體脂肪細胞內脂質累積并降低成脂基因PPARγ和C/EBP a 表達[18]。

通過實驗雖然證實了高濃度的二甲雙胍能抑制脂肪前體細胞的增殖和分化， 但正常血藥濃度的二甲雙胍對脂肪前體細胞增殖和細胞分化并無影響。在本實驗中應用二甲雙胍干預脂肪前體細胞的時間比較短， 如果在體內長期應用正常血藥濃度二甲雙胍， 是否會對脂肪前體細胞的細胞增殖和細胞分化產生還需進一步研究證實。此外， 流行病學調查資料提示二甲雙胍還可以降低某些腫瘤的發病率和病死率[19]， 其可能機制為激活LKBI/AMPK通路[20]， 從而誘導某些腫瘤細胞的細胞周期停滯以及誘導細胞凋亡[21]。這從側面提示， 假如二甲雙胍在體內能夠誘導或促進脂肪前體細胞的凋亡， 這可能會成為二甲雙胍減輕體重一個重要機制。本實驗應用不同濃度的二甲雙胍對脂肪前體細胞的增殖進行干預， 發現用高濃度（≥5 mmol/L）的二甲雙胍對脂肪前體細胞的增殖過程進行干預后， 鏡下觀察細胞的數量明顯減少， 且有凋亡小體的出現， 提示二甲雙胍可能促進脂肪前體細胞的凋亡， 但二甲雙胍真正能否促進脂肪前體細胞的凋亡以及可能的作用機制還需要進一步研究。

綜上所述， 二甲雙胍濃度較低（≤0.5 mmol/L）時對3T3-L1脂肪前體細胞增殖無影響;二甲雙胍濃度較高（≥5 mmol/L）時3T3-L1脂肪前體細胞的增殖可明顯被抑制， 且隨著藥物的濃度增加抑制作用增強;二甲雙胍濃度較高（≥5 mmol/L）可能促進3T3-L1脂肪前體細胞的凋亡。低濃度的二甲雙胍（≤0.5 mmol/L）對3T3-L1脂肪前體細胞的分化無影響;3T3-L1脂肪前體細胞的分化可被5 mmol/L的二甲雙胍抑制。

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[收稿日期：2019-08-28 ]