miR-9靶向FOXP1對彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的作用及機制研究

聞淑娟　張珍連　李姍　胡欣　朱琳　阿孜古麗·麥合麥提　楊順娥

[摘要]目的 探討FOXP1上游靶標miR-9對彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）細胞的作用及機制。方法 Targetscan分析miR-9與FOXP1的結合，miR-9與FOXP1結合通過熒光素酶基因報告實驗驗證;以轉染mimic Con為對照組，轉染mimic miR-9過表達miR-9后，Western blot檢測FOXP1表達變化;實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測人DLBCL細胞OCI-Ly3和人B淋巴母細胞IM9中miR-9的表達水平;過表達miR-9后，體外檢測OCI-Ly3的增殖以及侵襲能力的變化。結果 轉染miR-9后，mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組的熒光素酶活性低于轉染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組，差異有統計學意義（P<0.0001）;過表達miR-9后，mimic miR-9組的FOXP1表達水平低于mimic Con組，差異有統計學意義（P<0.05）;miR-9在人DLBCL細胞系OCI-Ly3細胞中的表達水平低于B淋巴母細胞，差異有統計學意義（P<0.05）;過表達miR-9后，OCI-Ly3細胞的增殖和侵襲能力低于mimic Con組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 miR-9下調通過靶向FOXP1促進彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的增殖和侵襲。

[關鍵詞]彌漫性大B細胞淋巴瘤;miRNA;miR-9;FOXP1

[中圖分類號] R733.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）10（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of FOXP1 upstream target miR-9 on diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） cells. Methods Targetscan was used to analyze the binding of miR-9 to FOXP1， the luciferase gene reporter assay confirmed the binding of miR-9 to FOXP1. Transfection mimic Con was used as the control group， after transfection of mimic miR-9 after overexpression of miR-9， FOXP1 expression was detected by Western blot. The real-time fluorogenic quantitative PCR （RT-PCR） was used to detect the expression level of miR-9 in human DLBCL cells OCI-Ly3 and B lymphoblastic cell IM9. After overexpression of miR-9， the proliferation and invasion ability of OCI-Ly3 were detected in vitro. Results After transfection with miR-9， the luciferase activity of the mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT group was lower than that in the mimic Con+FOXP1 3′UTR WT group， the difference was statistically significant （P<0.0001）. After overexpression of miR-9， the FOXP1 expression level of mimic miR-9 group was lower than that in the mimic Con group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of miR-9 in human DLBCL cell line OCI-Ly3 was lower than that of B lymphocyte， the difference was statistically significant （P<0.05）. After overexpression of miR-9， OCI-Ly3 cells had lower proliferation and invasion ability than those in the mimic Con group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Down-regulation of miR-9 promotes proliferation and invasion of diffuse large B-cell lymphoma cells by targeting FOXP1.

[Key words] Diffuse large B-cell lymphoma; miRNA; miR-9; FOXP1

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHLs）的30%～40%，是常見的淋巴系統惡性腫瘤之一[1]。所有年齡組中都檢測得到DLBCL，包括兒科患者，然而，隨著患者年齡的增長，DLBCL 發病率也增加，70歲以上患者最常見。男性DLBCL的發病率相對高于女性[2-3]。DLBCLs的生物學特性、基因突變和免疫表型多種多樣，直到現在，DLBCL的發病機制仍然很不清楚[4]。

miRNA是具有單鏈的非編碼RNA分子[5]。miRNA可以促進其靶向的mRNA降解，干擾翻譯過程發揮基因表達的調控作用[6]。miRNA在幾乎所有細胞過程中都具有重要作用，它們在細胞增殖分化等許多細胞過程發揮作用[7]。近年來，研究發現miRNA已成為癌癥進展中的重要參與者。miRNA可以抑制或促進腫瘤的發生發展[8]。例如，過表達的miR-142-5p可以抑制胰腺癌的生長[9];miR-187靶向MAPK12抑制骨肉瘤的生長;免疫反應中，miR-424通過T細胞調節上皮性卵巢癌的化療耐藥性[10]。miR-9的表達與細胞分化、增殖、遷移和轉移緊密相關。在多種癌癥中觀察到miR-9的異常表達[11]，表明miR-9參與癌癥的發生。然而，目前有關miR-9在DLBCL中的作用尚不確定。

本研究通過miRNA靶基因預測軟件Targetscan數據庫預測FOXP1上游靶標分子miR-9，檢測DLBCL細胞OCI-Ly3中miR-9的表達水平，并測試miR-9對OCI-Ly3增殖和侵襲能力的影響，探究miR-9對彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的作用及機制，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

DLBCL細胞系OCI-Ly3（上海拜力生物有限科技公司）;人B淋巴母細胞系IM9（武漢尚碼生物科技有限公司）;RPMI1640（sigma）;FBS（杭州四季青）;miR-9及U6特異性引物（廣州銳博生物科技有限公司）;mimic miR-9（廣州銳博生物科技有限公司）;FOXP1抗體（proteintech）;PCR試劑盒（Vazyme Biotech）。

1.2方法

1.2.1細胞培養? DLBCL細胞系OCI-Ly3和人B淋巴母細胞系IM9在37℃細胞恒溫箱中孵育，RPMI1640補充有10%（V/V）的FBS、青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）。

1.2.2實時熒光定量? 實時熒光定量PCR（RT-PCR）TRIzol法提取總RNA。使用PCR試劑盒逆轉錄miR-9。之后，使用RT-PCR檢測成熟miR-9的表達，使用U6特異性引物作為內參。

1.2.3熒光素酶基因報告實驗? 根據Targetscan軟件預測miR-9與FOXP1 mRNA 3′-UTR區結合序列。將含該結合位點的片段插入到熒光素酶報告基因質粒。構建兩組質粒：包含該結合位點的野生型質粒（FOXP1 3′UTR WT）以及突變該結合位點的突變質粒（FOXP1 3′UTR Mut）。轉染OCL-LY-3細胞miR-9 mimic和兩組質粒，摩爾比為50∶1。miRNA對照用作陰性對照。24 h后根據說明書（Promega，E2920），測定熒光素酶活性。

1.2.4 miR-9轉染? 將OCI-Ly3細胞系鋪板，根據銳博生物科技公司提供的說明書，使用lipofectamine 2000進行轉染，mimic miR-9用于過表達miR-9，對照組轉染mimic Con。24～48 h后進行后續實驗。

1.2.5細胞增殖檢測? 對轉染miR-9 mimic的OCI-Ly3細胞進行細胞增殖檢測，檢測起點記為0 h，分別在0、6、12、24 h收集細胞，實驗血球計數板進行細胞計數。

1.2.6細胞侵襲能力檢測? 使用Transwell進行體外細胞侵襲實驗。簡而言之，Transwell小室PVDF膜上用基質膠與處理，細胞恒溫箱中平衡2 h。PBS清洗1遍，在Transwell內室加入細胞懸液（1×105細胞/孔），恒溫箱中孵育24 h。輕輕擦去靠近內側細胞，另用甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色20 min，PBS洗3遍，顯微鏡下進行細胞計數。每組設三復孔。

1.2.7 Western blot分析? RIPA裂解液裂解細胞，在冰上提取總蛋白;于4℃條件下，12 000 g離心20 min;BCA蛋白定量;12%十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉法制得PVDF膜;用TBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;加入一抗（FOXP1，1∶1000），4℃過夜;用TBST洗滌3次，每次15 min;室溫孵育二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，1∶2000）2 h;用TBST洗滌3次，每次15 min;用化學發光顯色法顯影，拍照統計。

1.3實驗分組

分組包括如下：①熒光素基因報告實驗分組，包括mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組、mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組、mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut組及mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut組。②miR-9對FOXP1表達調控作用驗證分組，包括mimic Con組及mimic miR-9組。③miR-9在人DLBCL細胞OCI-Ly3和人B淋巴母細胞IM9中表達水平驗證分組，包括B淋巴母細胞組及人DLBCL組。④miR-9對OCI-Ly3細胞體外增殖以及侵襲能力的作用驗證：mimic Con組，mimic miR-9組。

1.4觀察指標

本研究觀察指標包括：①比較mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組與mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組的熒光素酶活性，熒光素酶活性降低降低，表明miR-9與FOXP1結合;②比較mimic Con組與mimic miR-9組的FOXP1表達水平，FOXP1表達水平降低，表明miR-9抑制FOXP1表達;③比較人DLBCL細胞OCI-Ly3和人B淋巴母細胞IM9中miR-9的表達水平;④比較mimic Con組與mimic miR-9組OCI-Ly3細胞增殖數目以及穿過Transwell的細胞數目，細胞計數降低，表明miR-9抑制OCI-ly3細胞體外增殖和侵襲。

1.5統計學方法

采用SPSS 11.5統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 miR-9與FOXP1結合

利用miRNA靶基因預測軟件Targetscan預測出miR-9與FOXP1直接結合，預測結果見圖1，封三。并采用熒光素酶實驗驗證miR-9與FOXP1的結合，結果提示，mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組的熒光素酶活性低于轉染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組，差異有統計學意義（P<0.0001），mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut組與mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut組的熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

2.2過表達miR-9對FOXP1表達的影響

過表達miR-9對FOXP1表達的影響，結果見圖3，結果提示，過表達miR-9抑制FOXP1表達。在DLBCL細胞系OCI-Ly3細胞中使用mimic miR-9過表達miR-9，mimic miR-9組的FOXP1表達水平低于mimic Con組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

2.3 miR-9在DLBCL細胞系和B淋巴母細胞中的表達情況

結果提示，人DLBCL細胞系OCI-Ly3細胞的miR-9表達水平低于B淋巴母細胞，差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

2.4過表達miR-9對OCI-Ly3細胞增殖的影響

在OCI-Ly3細胞中轉染miR-9 mimic后進行細胞增殖檢測，結果提示，在轉染后12、24、48 h后，mimic miR-9組的細胞數目少于mimic Con組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖6）。

2.5過表達miR-9對OCI-Ly3細胞體外侵襲能力的影響

在OCI-Ly3細胞中轉染miR-9 mimic后進行Transwell體外細胞侵襲實驗，mimic Con組穿過Transwell的細胞數為（879±24）個，mimic miR-9組穿過Transwell的數目為（487±28）個。mimic miR-9組穿過Transwell的數目少于mimic Con組，差異有統計學意義（t=26.635，P<0.001）。

3討論

FOXP1在許多生物過程中起著重要作用，包括T細胞和B細胞的發育和功能[12-15]。此外，FOXP1已被確認為是肝細胞癌、胰腺癌和各種類型的B細胞非霍奇金淋巴瘤的潛在致癌基因[16-18]。研究發現， DLBCL和粘膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤中，FOXP1的高表達與腫瘤預后不良相關聯，并且促使其轉變為侵襲性淋巴瘤[19-20]。長期以來，FOXP1被認為是DLBCL中推定的致癌基因，其通過促進B細胞存活，抑制漿細胞分化，增強Wnt信號傳導和抑制主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子表達等機制發揮致癌作用[21-23]。

miRNA在轉錄后水平介導mRNA降解從而調控基因表達。本研究通過Targetscan數據庫分析發現，miR-9可以與FOXP1的3′UTR區結合。通過熒光素酶實驗證實miR-9與FOXP1的結合。過表達miR-9則導致FOXP1的表達水平降低，進一步證實miR-9作為FOXP1的上游靶標分子，調控FOXP1的表達。而FOXP1已經在DLBCL中進行了廣泛的研究，已知它可以調節B細胞的存活和侵襲性，高FOXP1水平的DLBCL預后更差。因此其上游靶標分子miR-9在DLBCL中可能發揮重要作用。RT-PCR結果顯示，在DLBCL細胞系中miR-9的表達低于人淋巴母細胞IM9。鑒于miR-9與FOXP1的3′-UTR區的結合及其對FOXP1的調節作用，miR-9的異常表達可能是導致FOXP1在DLBCL中高表達的機制之一。在DLBCL細胞系OCI-Ly3中過表達miR-9，可以抑制OCL-Ly3細胞的增殖和侵襲能力。表明miR-9可以靶向FOXP1調節DLBCL細胞的增殖和侵襲能力。miR-9的表達失調可能是促進DLBCL發展的機制之一。

綜上所述，miR-9通過靶向FOXP1在DLBCL中起關鍵作用。MiR-9表達失調可通過上調其下游靶標分子FOXP1表達促進DLBCL細胞增殖和轉移。本研究有助于了解miR-9在DLBCL中的作用及機制，然而，miR-9是否也通其他分子靶標調節DLBCL發生發展過程，仍有待進一步的研究。

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（收稿日期：2019-07-04? 本文編輯：孟慶卿）