豬日本乙型腦炎及豬細小病毒復合PCR檢測方法的建立

呂玉金　吳鳳筍　劉勝利　李文剛

摘要：根據GenBank上登錄的日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）與豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）參考基因序列，設計合成2對特異性引物，在建立優化單項PCR檢測方法的基礎上，建立了PPV-JEV復合PCR檢測方法，可擴增出預期的238 bp和152 bp特異性片段。該方法敏感性高、穩定性好、特異性強，臨床樣品檢測結果與單項PCR檢測結果符合率100%，該方法適合JEV和PPV的聯合檢測和鑒別診斷。

關鍵詞：豬;日本乙型腦炎病毒;細小病毒;復合PCR

中圖分類號：S852.65 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0176-03

收稿日期：2018-07-20

基金項目：河南牧業經濟學院預防獸醫學重點學科建設項目（編號：MXK2016102）。

作者簡介：呂玉金（1984—），女，河南商丘人，碩士，講師，主要從事動物傳染病發病機理及防制研究。E-mail：272166760@qq.com。

通信作者：李文剛，博士，教授，主要從事動物傳染病防控研究。E-mail：wengang-li@126.com。

隨著我國養豬業的發展，豬病呈現多病原混合感染或繼發感染的現象[1]。流行性日本乙型腦炎（Japan eseencephalitis，JE）又叫日本乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒（JEV）引起的一種重要的人獸共患傳染病，豬群最易感，妊娠母豬主要表現為流產、高熱、死胎和木乃伊胎，公豬表現為睪丸炎，被世界衛生組織列為需要重點控制的傳染病之一[2-3]。豬細小病毒病是由豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）引起的豬繁殖障礙性疾病，該病主要感染初產母豬，臨床表現為胎兒和胚胎的感染和死亡。血清學陰性的母豬主要在懷孕前半期通過口鼻感染病毒，病毒大量繁殖后可引發母豬的病毒血癥并且隨血液循環到達胎盤傳染給胎兒，形成垂直傳播[4]。該病在我國多發生于4—10月，豬感染后可終生帶毒，全場豬在短時間內即可感染本病。豬在感染PPV后的1～6 d內會出現病毒血癥現象，3～7 d內即可經糞便排毒，1周后可以檢測到相應抗體[5]。母豬感染PPV后，病毒主要分布于機體內一些快速增生的組織（例如淋巴結生發中心、結腸固有層、腎間質等）[6]。研究表明，PPV僅會在活的豬胚胎中復制，感染胚胎一旦死亡就會被母體重吸收，病毒則無法在母體子宮內傳播擴散，若感染胚胎存活，則會在子宮內傳播病毒，致使同窩的其他胎兒也發生感染[7]。

JEV、PPV感染都可造成母豬繁殖障礙性疾病，檢測這2種病毒有多種方法，包括病毒的分離鑒定、酶聯免疫吸附試驗和免疫熒光試驗等，但都存在敏感性低、特異性差等缺陷[8]。近年來，聚合酶鏈式反應（PCR）因其特異性好，靈敏度高，被廣泛應用于各種病原的檢測，尤其是多重PCR，比常規PCR更高效，目前研究較多[9]。為快速鑒別診斷這2種病毒病，本研究旨在建立JEV-PPV復合PCR方法，并將該方法初步應用于臨床樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒

JEV疫苗株、PPV疫苗株及實驗室保存的疑似感染JEV、PPV的病料。病料采取自河南某養豬場的疑似感染JEV、PPV病死豬的肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結等9份病料，每頭豬的各種組織混合為1份病毒。

1.2 主要試劑

Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶，購自上海生物工程公司;HipureViralRNASpinKit試劑盒、M-MLV H-First Sand Sythesis Kit試劑盒，購自Magen公司;DL500 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 病毒DNA的提取及檢測

應用Sangon Biotech的Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒提取PPV病毒DNA，按照試劑盒標準抽提步驟進行，其中溶液A在65 ℃預熱后沉淀溶解完全后使用，最后用100 μL經65 ℃預熱的ddH2O洗脫。用超微量紫外分光光度計對所提取DNA的濃度進行檢測。

1.3.2 病毒RNA的提取、檢測及反轉錄

采用Magen公司的HipureViralRNASpinKit試劑盒提取JEV的RNA，嚴格按照試劑盒的操作步驟進行。Carrier RNA固體在使用前須用DEPC水溶解完全，濃度為1 μg/μL，注意分裝保存。另外，Buffer VHB、Buffer RW2用前必須用無水乙醇稀釋。最后采用100 μL DEPC水洗脫，并使用超微量紫外分光光度計進行RNA濃度的測定。

然后利用Magen公司的M-MLV H-First Sand Sythesis Kit試劑盒將提取的RNA進行反轉錄。取適量RNA溶液，依次加入適量RNA溶液、0ligo （dT）1 μL，dNTPs 1 μL，DEPC水補足至13 μL，經過孵育冰上冷卻后，再加入5×First Stand Buffer 4 μL，0.1 M DTT 1 μL，M-MLV RNase HRT 1 μL，RNase Ihibior（40 U/μL）1 μL，離心，反應45 ℃ 30 min，85 ℃ 10 s后瞬離，將產物立即放置-20 ℃保存備用。

1.3.3 引物的設計和合成

根據GenBank公布的PPV和JEV的全基因序列，按照引物設計原則設計、選擇引物，并對其特異性進行鑒定，均具有良好的特異性。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物設計見表1。

1.3.4 單項PCR反應體系的建立 單項PCR反應體系見表2。

94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，梯度退火溫度（49.5、507、52.9、54.1、55.4、57.8、587、59.9 ℃）下30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定最佳退火溫度。

1.3.5 復合PCR反應體系的建立

在單項PCR的基礎上，建立多重PCR反應體系（表3）。

94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，梯度退火溫度（49.5、50.7、52.9、54.1、55.4、57.8、58.7、59.9 ℃）下30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。經1.5%瓊糖凝膠電泳檢測，確定最佳退火溫度。

1.3.6 敏感性試驗

將病毒模板進行10倍系列稀釋，以ddH2O為模板作為為陰性對照，進行單項和多重PCR擴增，以其模板最高稀釋倍數擴增呈陽性為其PCR的敏感度。

1.3.7 特異性試驗

分別以PPV、JEV、豬瘟病毒（CSFV）和豬偽狂犬病毒（PRV）基因組為模板，以ddH2O為模板作為陰性對照，應用復合PCR方法進行擴增，電泳，驗證其特異性。

1.3.8 穩定性試驗

對PPV和JEV重復檢測5次，以驗證該方法的穩定性。

1.3.9 臨床樣品檢測

應用建立的單項PCR與多重PCR方法，檢測實驗室保存的9份疑似感染PPV和JEV的病料，比較兩者檢測結果的符合率。

2 結果

2.1 DNA的檢測結果

提取的PPV的DNA濃度為141.9 ng/μL，D260 nm/D280 nm為1.91，比值在1.8～2.0 之間，表明提取的基因組DNA質量非常好。

2.2 RNA的檢測結果

提取的JEV的RNA濃度為1 325.6 ng/μL，D260 nm/D280 nm為1.94，表明提取的RNA質量非常好。

2.3 PPV和JEV的單項PCR擴增結果

電泳結果顯示，PPV和JEV分別擴增出152、238 bp的片段。PPV單項PCR的最佳退火是57.8 ℃，JEV單項PCR的最佳退火溫度是58.7 ℃，見圖1和圖2。

2.4 復合PCR擴增結果

電泳結果（圖3）顯示，PPV和JEV的最佳退火溫度是54.1 ℃。

2.5 敏感性試驗

電泳結果（圖4）顯示，可檢測到PPV和JEV的稀釋濃度分別為10-7、10-5。

2.6 特異性試驗

由圖5可知，電泳結果顯示，PPV和JEV可擴增出目的條帶，而CSFV和PRV則沒有產生，說明該方法特異性良好。

2.7 穩定性試驗

以建立的多重PCR方法對PPV和JEV重復檢測5次。由圖6可知，5次的檢測結果一致，說明該方法穩定性較好。

2.8 臨床樣品檢測

利用建立的復合PCR方法對9份臨床樣品進行檢測，然后使用同樣的特異性引物進行單項PCR檢測，結果顯示兩者結果符合率100%（表4）。

3 討論與分析

目前，國內外發生的動物病毒病或一個征候群的疫病多同時涉及DNA和RNA兩類病毒[10]。本研究從感染PPV和JEV[CM（24*8]的病死豬組織中提取了DNA和RNA，且在紫外線波長260 nm和280 nm處的比值均在1.8和2.0之間，符合純的DNA D260 nm/D280 nm的值為2.0、純的RNA D260 nm/D280 nm的值為1.8的要求[11]。

在多重PCR反應過程中，引物的設計至關重要，它關系到多重PCR反應的成功與否。本試驗針對PPV和JEV這2種常見病毒的保守基因分別設計2對特異性引物，應用DNAstar軟件進行綜合分析，結果顯示，2對特異性引物較好且同源性較低，各擴增片段相差不大，可在同一種濃度的電泳膠下進行。本試驗設計的2對引物經試驗驗證，均是擴增效果較好的引物。

本研究在大量前期試驗的基礎上，首先確定了PPV和JEV單項PCR反應的最佳反應條件和反應程序，在此基礎上摸索出了多重PCR的最佳反應條件，彌補了多重PCR因引物之間交叉干擾而導致敏感性降低的缺點。敏感性試驗結果表明，該雙重PCR具有較強的敏感性。本研究建立的PPV和JEV雙重PCR檢測方法，實現了這2種病毒的同步檢測，為JEV和PPV感染的快速檢測和流行病學調查奠定了基礎。

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