利用基于單鏈抗體的ELISA檢測蔬菜中殺螟松殘留

羅義輝　陳佳　徐金娥

摘要：為建立蔬菜中殺螟松殘留快速檢測方法，首先測定前期通過核糖體展示篩選所獲得的抗殺螟松單鏈抗體的親和力以及該抗體與其他有機磷農(nóng)藥的交叉反應率，然后建立基于該抗體的酶聯(lián)免疫分析（ELISA）測定實際蔬菜樣品中殺螟松殘留的方法。研究表明：單鏈抗體ScFv-AF132與殺螟松的解離平衡常數(shù)為2.66×10-10 mol/L，與其他有機磷農(nóng)藥的交叉反應率≤0.17%。測得3種重慶市市售蔬菜的殺螟松殘留，分別為0.532、0.004 21、0.235 mg/kg。樣本添加回收率試驗顯示，平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD（相對標準差）≤2.26%，說明本方法可靠，能在實際蔬菜樣品殺螟松殘留的快速檢測中得到應用。

關鍵詞：殺螟松;有機磷檢測;單鏈抗體;ELISA;交叉反應率;回收率;殘留;回收率

中圖分類號： O657.71文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0200-03

收稿日期：2018-07-18

基金項目：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局公益性行業(yè)科研專項（編號：2012104003）。

作者簡介：羅義輝（1966—），男，四川武勝人，博士，講師，主要從事有害化學品快速檢測研究。E-mail：383620115@qq.com。

通信作者：徐金娥，碩士，講師，主要從事圖書出版與生物信息學研究。E-mail：915847121@qq.com。

殺螟松又名殺螟硫磷，化學名稱為O，O-二甲基-O-（3-甲基-4-硝基苯基）硫代磷酸酯，是常用的有機磷殺蟲劑之一，毒性中等。有機磷殺蟲劑廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因為它具有高活性、易降解等優(yōu)點。同時，農(nóng)產(chǎn)品中有機磷殺蟲劑等農(nóng)藥殘留對人們健康的影響也引人關注[1-2]。目前，對有機磷殺蟲劑的檢測一般采用色譜法，如氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜等，這些方法的明顯不足是樣品準備程序復雜、勞動強度大、成本較高等，尤其不太適用于對蔬菜等需要保鮮的農(nóng)產(chǎn)品的檢測[3]。而以酶聯(lián)免疫分析（ELISA）為代表的免疫檢測技術由于具有高靈敏度、簡單快速和廉價等優(yōu)點，近年來已成重要的農(nóng)殘檢測手段。

單鏈抗體（ScFv）是一種重組抗體，通過基因重組與表達獲得[4-5]。與多克隆抗體相比，單鏈抗體具有與抗原更強的結(jié)合力;而與單克隆抗體相比，單鏈抗體具有生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，單鏈抗體因此在醫(yī)學領域得到廣泛應用[6-7]。而將單鏈抗體用于農(nóng)藥殘留檢測的研究較少[8-10]。本研究基于前期研究[9]通過基因重組、篩選及表達等技術所得到的單鏈抗體與ELISA相結(jié)合，首次建立了基于單鏈抗體的ELISA檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，為快速檢測農(nóng)藥殘留提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

儀器與試劑：殺螟松等有機磷農(nóng)藥標準品，購自國家標準物質(zhì)中心;Model 550酶標儀，購自Bio-Rad公司;卵清白蛋白（OVA）HisLinkTM蛋白純化系統(tǒng)，購自Promega公司;HEPES緩沖溶液、BIAcore X系統(tǒng)、CM5芯片，購自通用電氣（GE）公司。

蔬菜樣品：蔬菜樣品購于重慶市陳家橋菜市場。

1.2 單鏈抗體親和力分析

將殺螟松-OVA（篩選抗原）與BIAcore專用CM5芯片偶聯(lián)后置于BIAcore X系統(tǒng)中，分別將前期研究通過3輪核糖體展示技術從小鼠的抗體基因文庫篩選所獲得3株ScFv抗體蛋白以及原始文庫（未經(jīng)篩選）隨機選取的抗體蛋白（小鼠血清）注入BIAcore X，流經(jīng)固定有篩選抗原的CM5芯片表面，記錄殺螟松-OVA與抗體蛋白結(jié)合過程。

1.3 單鏈抗體特異性分析

用競爭酶聯(lián)免疫分析（IC-ELISA）測定3株抗體蛋白（ScFv-AF50 、ScFv-AF93和ScFv-AF132）與5種常用有機磷農(nóng)藥的交叉反應率來說明抗體蛋白對殺螟松結(jié)合的特異性。

競爭酶聯(lián)免疫分析按經(jīng)典步驟操作[11]（2步之間均棄上步溶液，并用含0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗板3次）：（1）包被。用質(zhì)量濃度為20 μg/mL的單鏈抗體100 μL/孔，做3個平行，4 ℃過夜。（2）封閉。用1%明膠100 μL/孔，37 ℃ 放置2 h。（3）結(jié)合。用5種常用的有機磷農(nóng)藥（殺螟松、甲胺磷、甲拌磷、二溴磷、敵敵畏）梯度稀釋液，50 μL/孔，37 ℃放置1 h。（4）加篩選抗原殺螟松-OVA，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，50 μL/孔，37 ℃放置1 h。（5）加二抗。用抗OVA抗體（辣根過氧化物酶標記），100 μL/孔，37 ℃放置 2 h。（6）顯色。加底物100 μL/孔，暗處顯色5～15 min，用 2 mol/L 硫酸終止顯色，酶標儀讀取D450 nm。

交叉反應率的獲得：首先通過繪制標準曲線求不同有機磷農(nóng)藥的半抑制濃度IC50，標準曲線橫坐標為有機磷濃度的常用對數(shù)，縱坐標為結(jié)合率（B/B0，B為梯度濃度的有機磷的D450 nm，B0為不加有機磷的D450 nm）。然后利用下式計算抗體蛋白對不同有機磷農(nóng)藥的交叉反應率[12]：

交叉反應率（CR）=[SX（]殺螟松的IC50其他有機磷的IC50[SX）]×100%。

1.4 蔬菜中殺螟松殘留的測定

蔬菜樣品前處理：將從普通農(nóng)貿(mào)市場購買的蔬菜樣品（甘藍、黃瓜、萵筍）搗碎，稱取10.00 g，用30 mL丙酮浸泡，室溫下振蕩30 min，離心分離，濾去殘渣，濾渣用25 mL丙酮洗滌3次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去丙酮，用100 mL磷酸鹽緩沖液溶解待用。

蔬菜樣品殺螟松殘留的測定：利用競爭酶聯(lián)免疫分析測定殺螟松，步驟與“1.3”節(jié)中交叉反應率測定相同，只是在第3步結(jié)合時加入的是濃度梯度 （0、1、2、4、8、16 ng/mL） 殺螟松標準溶液或樣品處理所得溶液。用殺螟松標準溶液讀取的D450 nm值建立標準曲線，用內(nèi)插法先求得溶液中殺螟松濃度，再求算蔬菜中殺螟松含量。

1.5 樣本添加回收率試驗

向蔬菜樣品（甘藍、黃瓜、萵筍）各加入梯度量的殺螟松（0.10、1.00、10.00 mg/kg），4 ℃放置過夜，然后以“1.4”節(jié)中同樣的方法對殺螟松殘留進行提取、測定，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高親和力抗體

作為對比，筆者測定了從原始文庫中隨機挑取9個抗體蛋白和篩選后獲得的3個單鏈抗體蛋白與殺螟松-OVA結(jié)合，所得結(jié)果如圖1所示。圖1中橫坐標為時間，縱坐標為響應值（RU），由于本試驗所用的CM5芯片已經(jīng)耦合了篩選抗原殺螟松-OVA，RU升高即顯示有物質(zhì)與篩選抗原結(jié)合。

圖1-A中0～120 s是樣品流經(jīng)芯片的時間，RU無明顯變化，說明這9個單鏈抗體蛋白幾乎不與殺螟松-OVA結(jié)合。而經(jīng)核糖體展示篩選后的單鏈抗體部分與殺螟松-OVA有結(jié)合，其中有3株與殺螟松-OVA結(jié)合較強（圖1-B），圖1-B中0～120 s的RU升高了300～700，說明篩選所獲得的3個抗體蛋白與殺螟松-OVA有較強地結(jié)合，120 s之后RU降低，表示在進樣結(jié)束后，緩沖液繼續(xù)流經(jīng)芯片將部分抗體蛋白洗脫下來。

為了測定抗體蛋白與殺螟松的親和力，將3株ScFv抗體蛋白進行梯度稀釋（8、4、2、1 nmol/L），利用BIAcore測定梯度濃度的單鏈抗體蛋白與殺螟松-OVA的結(jié)合-解離過程，再利用BIAcore evaluation軟件對結(jié)合-解離曲線進行數(shù)據(jù)擬合以求算3株抗體蛋白的解離平衡常數(shù)，3株單鏈抗體（ScFv-AF50 、ScFv-AF93和ScFv-AF132）解離平衡常數(shù)分別為4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10 mol/L，解離平衡常數(shù)越小，說明抗體與抗原親和力越強。其中，解離速率最小的單鏈抗體ScFv-AF132被選為下一步的試驗。

2.2 抗體的特異性

利用競爭ELISA測定了單鏈抗體ScFv-AF132的選擇性：分別以有機磷質(zhì)量濃度的對數(shù)lgC、結(jié)合率B/B0為橫坐標、縱坐標繪制結(jié)合標準曲線，圖2是單鏈抗體ScFv-AF132對殺螟松的結(jié)合標準曲線。

通過該結(jié)合標準曲線可獲得殺螟松對單鏈抗體ScFv-AF132的半抑制濃度IC50為1.6 ng/mL，再通過不同有機磷農(nóng)藥的半抑制濃度IC50計算交叉反應率（表2），作為對比，筆者也測定了小鼠血清（多克隆抗體）對有機磷的交叉反應率。從表2可以看出，3株抗體蛋白與其他有機磷農(nóng)藥的交叉反應率≤0.17%，而小鼠血清其他有機磷農(nóng)藥交叉反應率≤7.6%，說明篩選提高了抗體對殺螟松的特異性。

2.3 蔬菜中殺螟松的測定

利用IC-ELISA來測定蔬菜中的殺螟松。先建立標準曲線：橫坐標為殺螟松濃度，縱坐標為與之對應的D450nm（加入不同濃度殺螟松與殺螟松濃度為0時的D450 nm之差），結(jié)果如圖3所示。

通過標準曲線的數(shù)據(jù)擬合可得到回歸方程：D450 nm=0.169C+0.012，先通過測定蔬菜提取液與空白液的D450 nm值，再利用回歸方程測定提取液中殺螟松濃度，最后得到3種蔬菜樣品中殺螟松殘留，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，本次測定的3種樣品中均有一定的殺螟松殘留，黃瓜中殺螟松殘留最少，甘藍中的殘留量最高，而國家標準對上述3種蔬菜中殺螟松的殘留量均 ≤0.5 mg/kg（《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》GB 2763—2014）[13]，可見本次測定的甘藍樣品中殺螟松殘留超標，黃瓜、萵筍中殺螟松殘留低于國家標準。但是，由于本試驗屬于小樣本取樣，蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留是否超標還須進一步的試驗驗證。

2.4 樣品添加回收率

分別向3種新鮮蔬菜中添加濃度梯度（0.10、1.0、10 mg/kg）的殺螟松，進行樣品添加回收率試驗以檢驗本方法的精密度，測定結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，本試驗的平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD（相對標準差）≤2.26%，說明本方法可靠，能在實際蔬菜樣品殺螟松殘留的快速檢測中得到應用。

3 結(jié)論與討論

本研究初步建立了基于單鏈抗體的競爭ELISA測定實際蔬菜樣品中殺螟松的方法，利用該方法測得3種市售蔬菜（甘藍、黃瓜、萵筍）的殺螟松殘留量，分別為0.532 00、0.004 21、0.235 00 mg/kg。與農(nóng)殘標準對比可知，甘藍樣品中殺螟松殘留超標，黃瓜、萵筍中殺螟松殘留低于國家標準。樣本添加回收率試驗顯示，平均回收率介于90.3%～112.8%，RSD≤2.26%，說明本方法可靠，能在實際蔬菜樣品中殺螟松殘留的快速檢中得到應用。

由于競爭ELISA具有低成本、無需大型設備且能批量檢測等優(yōu)點，已經(jīng)成為農(nóng)藥殘留快速檢測的主要方法之一，已有較多關于ELISA用于農(nóng)藥殘留檢測的報道，這些報道的ELISA往往基于多克隆抗體[14-18]或單克隆抗體[19-21]，多克隆抗體的缺點是特異性較差（本研究的交叉反應率的對比試驗也說明了這一點），且不同動物、不同批次免疫所產(chǎn)生的多克隆抗體的質(zhì)量往往也差異明顯。而單克隆抗體則特異性好，缺點是造價高，這是單克隆抗體的制備方法所決定的。本研究所使用的重組抗體具有單克隆抗體高親和力、高特異性的優(yōu)點，若批量生產(chǎn)，則較單克隆抗體廉價。當然，重組抗體的前期投入較高，如cDNA文庫的構(gòu)建、核糖體展示篩選單鏈抗體等。筆者所在的課題組也曾建立了基于單鏈抗體的BIAcore測定蔬菜中殺螟松殘留的方法[12]，2個方法所得的結(jié)果相似。不同之處在于：利用BIAcore無須用二抗，但BIAcore系統(tǒng)設備較大，不適應田間、市場等現(xiàn)場操作;競爭ELISA須標記二抗，穩(wěn)定性不如BIAcore，但適用于現(xiàn)場操作。若能將二者結(jié)合，根據(jù)不同的條件選擇測定方案，才能使該方法走向?qū)嶋H應用。

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