大孔吸附樹脂純化大黃中游離蒽醌的工藝

李鳳　劉蕓蕓　李愛峰　孫愛玲　柳仁民

摘要：擬研究大孔吸附樹脂純化大黃中游離蒽醌的最佳工藝。先以大黃中總游離蒽醌和苯乙烯酸的靜態(tài)吸附率和解吸率為指標(biāo)，對(duì)6種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂進(jìn)行篩選，然后通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附解吸試驗(yàn)優(yōu)化純化工藝。結(jié)果表明，HPD-400型大孔吸附樹脂對(duì)大黃中游離蒽醌和苯乙烯酸的吸附與解吸性能較好，且其吸附等溫線方程較符合Langmuir模型;確定最佳吸附條件如下：pH值4.5，上樣液濃度4 mg/mL，最大上樣量7 BV;最佳洗脫條件如下：先用70 BV的0.2 mol/L NaHCO3溶液從大黃中分離出苯乙烯酸及雜質(zhì)，再用15 BV的95%乙醇洗脫游離蒽醌;總游離蒽醌純度由41.17%提高到了82.60%。HPD-400型大孔吸附樹脂可以有效純化大黃游離蒽醌。

關(guān)鍵詞：大黃;游離蒽醌;大孔吸附樹脂;純化;Langmuir模型

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0203-06

收稿日期：2018-07-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21675071）;山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016GSF202007）。

作者簡(jiǎn)介：李 鳳（1990—），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事藥物分離與分析研究。E-mail：lifeng8129@163.com。

通信作者：柳仁民，博士，教授，主要從事藥物分離與分析研究。E-mail：renminliu@126.com。

大黃（Radix et Rhizoma Rhei）為臨床常用的傳統(tǒng)中藥，具有清熱退火、活血化瘀、減肥降脂等功效[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃具有保肝、利膽、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能[3]。大黃的主要藥用成分為蒽醌類衍生物，分為游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌，游離型蒽醌主要有大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚[4-5];結(jié)合型蒽醌有番瀉苷A、B、C、D及大黃酸-8-葡萄糖苷、大黃素葡萄糖苷等[4-5]。

近年來，大孔吸附樹脂的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是在天然產(chǎn)物有效成分分離方面，它具有分離純化效果優(yōu)良的應(yīng)用特點(diǎn)[6-8]。目前，國(guó)內(nèi)利用大孔吸附樹脂對(duì)大黃成分的研究主要集中在對(duì)總蒽醌的純化，方法是使用大孔吸附樹脂以不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫[9-10]，但以大孔吸附樹脂用NaHCO3除去大黃中的苯乙烯酸和雜質(zhì)進(jìn)而純化蒽醌類化合物的研究尚未見報(bào)道。本研究采用無水乙醚和20%硫酸水溶液混合液（體積比1 ∶5）回流提取，以HPD-400型大孔吸附樹脂使用NaHCO3溶液就可以將雜質(zhì)以及苯乙烯酸分離出來，然后用95%乙醇純化得到高純度的總蒽醌類化合物。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其中的苯乙烯酸和5種蒽醌類物質(zhì)的峰面積，從而對(duì)其進(jìn)行定量分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粗提物制備及大孔吸附樹脂分離純化所用的溶劑均為分析純，購(gòu)自煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司;所用試劑NaHCO3、Na2CO3、NaOH為分析純，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;HPLC（高效液相色譜法）分析用的甲醇為色譜純，購(gòu)自美國(guó)TEDIA試劑公司;試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。ADS-7型、HPD-500型、HPD-826型、HPD-400型、HPD-100型和AB-8型大孔吸附樹脂，購(gòu)自滄州恩寶化工有限公司。大黃藥材購(gòu)于聊城利民大藥店總店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為正品藥材。

1.2 試驗(yàn)儀器

Thermo UitiMate 3000高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司;色譜柱SPHERIGEL ODS C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 分析方法

采用高效液相色譜儀測(cè)定目標(biāo)成分的峰面積進(jìn)行定量分析（成分的峰面積與濃度呈線性關(guān)系）。SPHERIGEL ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），流動(dòng)相使用甲醇-水（含0.1%磷酸）梯度洗脫（甲醇0～30 min，65%～85%;30～50 min，85%～95%），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為15 μL。

1.4 大黃提取物溶液的制備

稱取約200 g大黃藥材，經(jīng)高速藥物粉碎機(jī)粉碎至約40目，采用無水乙醚和20%硫酸水溶液混合液（體積比1 ∶5）回流提取3次，每次1.5 h，料液比為1 g ∶6 mL，合并乙醚回流提取液，濃縮得浸膏，冷藏備用。

1.5 大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選

1.5.1 大孔樹脂的預(yù)處理

新購(gòu)的大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，裝玻璃層析柱。先用乙醇洗脫至洗脫液加水不出現(xiàn)混濁，接著用去離子水洗至洗脫液無乙醇味，備用。

1.5.2 靜態(tài)吸附解吸性能的比較

因?yàn)槌煞值姆迕娣e與濃度呈線性關(guān)系，因此對(duì)6個(gè)目標(biāo)成分的峰面積進(jìn)行定量分析。大孔樹脂吸附率和解吸率的計(jì)算公式如下：

吸附率=（原液的總峰面積-吸附后藥液的總峰面積）/原液的總峰面積×100%;（1）

解吸率=解吸后藥液的總峰面積/（原液的總峰面積-吸附后藥液的總峰面積）×100%。（2）

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的6種型號(hào)的大孔樹脂：ADS-7型、HPD-500型、HPD-826型、HPD-400型、HPD-100型和AB-8型各5 g，分別裝入100 mL具塞磨口三角瓶中，各加入相同濃度的大黃提取物溶液50 mL。置于水浴恒溫振蕩器上，30 ℃恒溫振蕩12 h，分別取吸附后的溶液，用高效液相色譜儀檢測(cè)。經(jīng)計(jì)算得到各樹脂對(duì)6個(gè)目標(biāo)成分的吸附量和吸附率。分別取上述吸附飽和的樹脂，各加入95%乙醇 50 mL，用與吸附試驗(yàn)同樣的條件進(jìn)行解吸12 h。解吸完全后，取解吸液用高效液相色譜儀檢測(cè)。經(jīng)計(jì)算得到各樹脂對(duì)6個(gè)目標(biāo)成分的解吸率。

1.6 靜態(tài)吸附解吸工藝的考察

1.6.1 靜態(tài)吸附pH值的考察

準(zhǔn)確稱取7份預(yù)處理過的HPD-400型大孔樹脂各5 g，分別加入含藥量相同的pH值分別為1、3、4.5、6.5、8.5、10.5、11.5的溶液50 mL進(jìn)行靜態(tài)吸附。

1.6.2 吸附動(dòng)力學(xué)的考察

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理過的HPD-400型大孔樹脂10 g，加入大黃提取物溶液100 mL，按在“1.6.1”節(jié)中確立的最佳pH值下進(jìn)行靜態(tài)吸附，每隔30 min取樣1 mL，用HPLC進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.6.3 吸附等溫線的考察

取濃度分別為0.25、0.30、0.35、0.40、0.50、0.60 g/mL的大黃提取物溶液各20 mL，各加入1 g HPD-400樹脂，分別置于25、35、45 ℃恒溫?fù)u床上振搖進(jìn)行靜態(tài)吸附至飽和，測(cè)其吸附量，繪制吸附等溫線。為進(jìn)一步了解樹脂對(duì)大黃中目標(biāo)成分的吸附，選擇2種標(biāo)準(zhǔn)理論模型（Langmuir和Freundlich模型[11]），對(duì)25 ℃時(shí)的吸附等溫線進(jìn)行擬合，來探討25 ℃下樹脂與大黃蒽醌的吸附行為。Langmuir吸附等溫線模型，假定吸附劑的孔隙表面是均勻的，并且吸附分子之間的相互作用力可忽略不計(jì)，它適用于單分子層吸附[11];Freundlich模型，假設(shè)表面具有吸附熱不均勻分布的異質(zhì)表面，用于描述單分子層以及多分子層的吸附行為[11]。2種吸附等溫線模型的公式如下：

式中：qe為平衡吸附量，g/g;Ce為平衡濃度，g/mL;qm為最大吸附量，g/g;KL為L(zhǎng)angmuir吸附平衡常數(shù)，L/g;Kf為Freundlich系數(shù)，L/g;n為表觀常數(shù)。

1.6.4 純化溶劑的考察

取18 g樹脂置于60 mL大黃提取物溶液中，在“1.6.3”節(jié)中確立的最優(yōu)吸附溫度下靜態(tài)吸附至飽和（其余吸附條件同“1.6.3”節(jié)），從中取3份吸附飽和的樹脂各5 g，分別加入60 mL、0.2 mol/L NaHCO3、Na2CO3、NaOH溶液進(jìn)行靜態(tài)解吸，在1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、2 h各取1 mL溶液，調(diào)節(jié)pH值至中性后用甲醇定容，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 動(dòng)態(tài)吸附及洗脫行為的考察

1.7.1 上樣液濃度的考察

取3份20 g預(yù)處理過的HPD-400樹脂分別裝柱（30 cm×1.7 cm），分別加入含藥量為3、4、5 mg/mL的大黃提取物溶液，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，分別收集流出液，以1/2個(gè)柱體積作為1個(gè)流份，收集至流出液中各目標(biāo)成分含量不再變化。分別經(jīng)HPLC測(cè)定各流份中苯乙烯酸和5種蒽醌類物質(zhì)的峰面積。繪制HPD-400型樹脂在不同濃度下的動(dòng)態(tài)吸附曲線。

1.7.2 泄漏曲線的考察

準(zhǔn)確稱取20 g預(yù)處理過的HPD-400樹脂裝柱（30 cm×1.7 cm），加入含藥量為4 mg/mL的大黃提取物溶液，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，收集流出液，以1/2個(gè)柱體積作為1個(gè)流份，收集至流出液中6個(gè)目標(biāo)成分含量不再變化。

1.7.3 洗脫劑用量的考察

取HPD-400樹脂按“1.7.2”節(jié)確立的吸附條件進(jìn)行上柱吸附至飽和。使用0.2 mol/L NaHCO3溶液動(dòng)態(tài)洗脫苯乙烯酸及雜質(zhì)，收集流出液，直到流出液中幾乎不含有苯乙烯酸。再用95%乙醇動(dòng)態(tài)洗脫蒽醌類物質(zhì)，收集流出液，直到5種蒽醌類物質(zhì)被洗脫完全。

1.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 g預(yù)處理的HPD-400樹脂，裝柱（30 cm×1.7 cm），在各項(xiàng)優(yōu)選條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

如圖1所示，采用“1.3”節(jié)確立的HPLC條件，各成分分離良好，主要得到6個(gè)目標(biāo)成分。由前人研究結(jié)果可知，峰1至峰6分別是苯乙烯酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素，其中峰2至峰6為蒽醌類物質(zhì)[12-13]。

2.2 大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選

由表1可知，HPD-400型、HPD-100型和AB-8型樹脂的靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率均高于其他3種樹脂。其中 HPD-400型樹脂靜態(tài)吸附率最高，且HPD-400型樹脂對(duì)目標(biāo)成分的靜態(tài)解吸率也在65%以上。因此，選擇HPD-400型樹脂純化大黃中的游離蒽醌。

2.3 靜態(tài)吸附解吸工藝的考察

2.3.1 靜態(tài)吸附pH值的考察

從圖2中可以看出，在pH值為4.5時(shí)，6個(gè)目標(biāo)成分的吸附率均達(dá)到了最高值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，主要原因是蒽醌類物質(zhì)大多含有酚羥基因而呈現(xiàn)一定的酸性，在弱酸性條件下游離蒽醌容易被HPD-400型樹脂吸附，而在堿性條件下游離蒽醌則易發(fā)生分解及氧化，故不易被HPD-400型樹脂吸附。因此，確立HPD-400型樹脂靜態(tài)吸附的pH值為4.5。

2.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)的考察

由圖3可知，初始階段吸附量增長(zhǎng)幅度大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附量增長(zhǎng)幅度變得緩慢，在3 h以后樹脂吸附達(dá)到平衡，吸附量基本保持不變。因此，吸附時(shí)間確定為3 h。

2.3.3 吸附等溫線的考察

由圖4可知，隨著大黃提取物溶液濃度的增加，吸附量先迅速增加，然后增長(zhǎng)幅度越來越緩慢。同時(shí)可以看出，隨著溫度的升高，樹脂的吸附量降低。可能的解釋是，樹脂對(duì)大黃蒽醌的吸附過程是放熱的，溫度的升高不利于吸附。由表2可知，Langmuir吸附等溫線模型擬合的r2（0.971 3～0.998 7）大于用Freundlich模型擬合的 r2（0.862 2～0.950 6）。因此，Langmuir吸附等溫線模型能更好地描述HPD-400型大孔樹脂對(duì)大黃蒽醌的吸附作用。

2.3.4 純化溶劑的考察

如圖5所示，與使用Na2CO3、NaOH溶液相比，使用NaHCO3溶液只有苯乙烯酸被解吸出來，蒽醌類化合物完全沒有被解吸出來。因此，使用 0.2 mol/L NaHCO3作為純化蒽醌類物質(zhì)的溶劑，能夠使苯乙烯酸與蒽醌類物質(zhì)分離，從而提高蒽醌類物質(zhì)的純度。

2.4 動(dòng)態(tài)吸附及洗脫行為的考察

2.4.1 上樣液濃度的考察

從圖6可以看出，隨著大黃提取物溶液濃度的增加，大黃中6個(gè)目標(biāo)成分對(duì)HPD-400樹脂的穿透點(diǎn)提前，即達(dá)到飽和吸附量的吸附時(shí)間減少;吸附速率隨著溶液濃度的增加而增加。但是如果濃度太大，會(huì)造成傳質(zhì)阻力增加，上樣困難，為提高效率最終選擇4 mg/mL上樣濃度。

2.4.2 泄露曲線的考察

從圖7可以看出，在4 BV時(shí)出現(xiàn)了少量的6個(gè)目標(biāo)成分，到7～8 BV時(shí)，達(dá)到泄漏點(diǎn)，即達(dá)到平衡濃度時(shí)的1/10，16 BV時(shí)，HPD-400樹脂對(duì)目標(biāo)成分的吸附達(dá)到飽和。因此，確定上樣量為7 BV的樣品液。

2.4.3 洗脫劑用量的考察

由圖8-a可知，70 BV的 0.2 mol/L NaHCO3溶液可以將大黃中的苯乙烯酸完全洗脫下來。由圖8-b可知，當(dāng)用95%乙醇洗脫到3 BV時(shí)，大黃中總游離蒽醌洗脫量最大;當(dāng)用95%乙醇洗脫到[KG*5]15[KG*3]BV[KG*5]時(shí)，

HPD-400樹脂將大黃總游離蒽醌基本洗脫完全。因此，選擇70 BV的0.2 mol/L NaHCO3溶液洗脫大黃中的苯乙烯酸和雜質(zhì)，選擇15 BV的95%乙醇洗脫大黃中的總游離蒽醌。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取20 g預(yù)處理好的HPD-400型大孔吸附樹脂裝柱，量取7 BV濃度為4 mg/mL的大黃提取物溶液（pH值為4.5左右）上樣，吸附飽和后，先用70 BV的0.2 mol/L NaHCO3溶液洗脫并收集洗脫液，再用15 BV的95%乙醇洗脫并收集洗脫液，然后用高效液相色譜儀檢測(cè)（圖9），采用HPLC面積歸一化法計(jì)算95%乙醇洗脫部分的游離蒽醌的純度。由圖9可知，本驗(yàn)證試驗(yàn)較好地實(shí)現(xiàn)了苯乙烯酸與大黃中總游離蒽醌的分離， 提高了總游離蒽醌的純度，其純度由41.17%提高到了82.60%。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)大孔樹脂分離純化的主要工藝參數(shù)進(jìn)行考察，確立了最佳工藝，并對(duì)優(yōu)選工藝進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，選擇的最佳工藝達(dá)到了純化大黃中游離蒽醌類物質(zhì)的目的，總游離蒽醌類物質(zhì)的純度由41.17%提高到了82.60%。使用本試驗(yàn)確立的分離純化方法，只需2步洗脫就可以純化大黃中的總游離蒽醌。第1步洗脫使用NaHCO3溶液作為洗脫劑，只有苯乙烯酸被洗脫出來，蒽醌類化合物完全沒有被洗脫出來，第2步使用15 BV的95%乙醇洗脫游離蒽醌，避免了大黃游離蒽醌不必要的損失，與依次使用不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫來純化總游離蒽醌相比，洗脫步驟更加便捷，且方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、純化效果優(yōu)良。本試驗(yàn)確立的純化方法可以為進(jìn)一步研究大黃中的成分提供參考。

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