川芎嗪氨類衍生物合成方法工藝優化及抗血小板聚集活性評價

曾凡鵬，胡 光，羅麗梅，吳翔宇，鄭一敏

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054)

川芎嗪(ligustrazine,Lig)是從藥材川芎(RhizomaChuanxiong)中分離提純出的生物堿單體[1]。川芎嗪具有抑制血管平滑肌痙攣、改善心肌缺血、抑制血小板聚集、改善血液流變性[2-5]及抗自由基等特點，作為天然活性成分在藥物設計合成中被廣泛應用[6-10]，臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病的治療[11-13]。現有臨床上治療心腦血管疾病藥物，往往會造成出血副作用大、耐藥、代謝快等缺點[14-15]。

陳鴻飛等[16]報道川芎嗪衍生物合成條件為K2CO3堿性環境，60 ℃、6 h，使用甲苯進行減壓蒸餾除去DMF，乙酸乙酯與水進行萃取分離有機相，產率為60%左右，同時在中間體的制備過程中使用二氯亞砜鹵代反應，該方法反應劇烈且試劑較刺激，但未見文獻報川芎嗪氨類衍生物抗血小板聚集實驗。

本研究以川芎嗪為先導化合物，采用溴代鹵化法制備中間體，使用NaH作為堿性環境，后處理不需要進行過濾除去固體K2CO3，同時加入了相轉移催化劑。通過單因素實驗篩選最佳的溫度、時間以及原料配比，再采用正交試驗進行工藝優化，產率提高了20%左右，并對目標產物采用質譜和核磁結構進行了確認，隨后進行了抗血小板聚集實驗，實驗現報道如下。

1 試驗

1.1 儀器與試劑

儀器：核磁(NMR)-600 MHz測定(CDCl3，TMS為內標，瑞士Bruker公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(藍尼詩爾商貿有限公司)；Finnigan-LCQDECA (ESI-MS)(美國熱電公司)；PSL-1810型磁力攪拌低溫槽(EYELA東京理化器械株式會社)。

試劑：無水三乙胺、K2CO3、N,N-二甲基酰胺、(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(阿達瑪斯試劑公司)。

1.2 合成方法

以三溴化磷和(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇為原料，以四氫呋喃為溶劑，反應得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪，再與化合物對氨基苯甲酸甲酯化合物經過親核取代反應得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸甲酯川芎嗪氨類衍生物，最后經過水解得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)，川芎嗪氨類衍生物合成路線如圖1所示。

圖1 川芎嗪氨類衍生物合成路線

1.2.12-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪中間體的制備

在氬氣保護、無水條件下，將雙頸圓底燒瓶置于低溫反應器中冷至-5 ℃，加入5.0 mmol PBr3冷卻并攪拌5 min，再加入無水三乙胺0.34 mL繼續攪拌2～3 min，再稱取15.2 mmol(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇溶于20 mL 四氫呋喃溶液中，用滴液漏斗緩慢滴加到雙頸圓底燒瓶中，待滴加結束后，將反應裝置轉移至室溫反應8 h，TLC板檢測反應，反應結束后真空旋除殘留溶劑，殘留物加冰水進行淬滅，并用乙酸乙酯進行萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，真空旋除溶劑，殘留物經硅膠柱層析進行分離純化，最后得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪。

1.2.24-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸的合成

在氬氣保護、無水條件下，將雙頸圓底燒瓶置于低溫反應器中冷卻至-5 ℃，稱取200 mgNaH置于25 mL的雙頸圓底燒瓶中，再加入一定量對氨基苯酯類化合物，再稱取2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪531.6 mg，相轉移催化劑四丁基碘化銨0.05 g，最后量取15 mL N,N-二甲基酰胺溶劑加入雙頸圓底燒瓶中。反應溫度85 ℃、8 h得到目標產物，硅膠柱分離純化得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)川芎嗪衍生物。

1.2.3結構確認

m.p.131-133℃.1H NMR (MeOD,150 MHz)δ=6.73(s,1H,Ar-H),7.81(s,1H,Ar-H),6.75(s,1H,Ar-H),7.82(s,1H,Ar-H),2.56(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3),2.52(s,3H,CH3),4.46(s,2H,CH3).13C NMR (MeOD,600 MHz)δ=152.53,151.81,151.81,149.63,148.66,148.27,147.40,131.31,131.21,118.14,112.20,45.47,19.82,19.66,18.69.川芎嗪衍生物3d結構譜圖1H NMR(見圖2)和13C NMR(見圖3)。

圖2 化合物3 d的13C NMR

圖3 化合物3d的1H NMR

1.3 抗血小板聚集試驗方法

將制備好的富血小板血漿放在搖床里37 ℃溫育20 min，用移液槍吸取180 μL溫育好的PRP加入96孔板中，加樣時避免產生氣泡，如果有氣泡用加熱的針頭扎破。再加入10 μL待測藥品，終濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，37 ℃溫育振搖5 min，將酶標儀設置為震動1次時間為10 s，波長為570 nm。將96孔板置于酶標儀上快速震搖10 s測定吸光度，每30 s測定1次，連續測3次，記各孔3次吸光度均值為A0。之后加入誘導劑，誘導劑二磷酸腺苷(ADP)終濃度為5 μmol/L，繼續每30 s測定一次吸光度直至吸光度不再變化，記平行孔的吸光度均值為A，阿司匹林為陽性對照。

1.4 工藝優化

本工藝主要對第2步2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪與對氨基苯甲酸甲酯化合物反應合成的川芎嗪氨類衍生物進行單因素和正交試驗，以考察反應條件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1反應溶劑的考察

反應溶劑對收率的影響考察結果見表1。

表1 反應溶劑對收率的影響

由表1可知：乙腈、四氫呋喃沸點較低，不能滿足實驗要求的溫度。使用甲苯產率也相對較低，為60%。選擇DMF作為溶劑，產率可高達91%。

2.1.2反應時間的考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，選擇DMF為溶劑，改變反應時間，考察反應時間對收率的影響，結果見表2。

表2 反應時間對收率的影響

由表2可知：隨時間延長，反應產率不斷變大，8 h反應進入高峰期，11 h收率下降。

2.1.3原料配比考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，改變對氨基苯酯類化合物的量，考察了原料配比對收率的影響，結果見表3。

表3 反應原料配比對收率的影響

由表3可知：反應原料配比為1∶0.8時，收率可達72%；增加對氨基苯酯化合物的量，收率變大，當配比為1∶1.2時收率最大，繼續增加對氨基苯酯化合物的量，收率變小。

2.1.4反應環境考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，考察了反應環境堿性的強弱對收率的影響，結果見表4。

表4 反應環境對收率的影響

由表4可知：堿性強弱對反應的收率有較高的影響。K2CO3的收率為52%。強堿NaH的收率高達89%。

2.1.5反應溫度考察

由表5可知：溫度對反應的收率有較高的影響。65 ℃時的收率為68%，85 ℃時的收率高達88%。

表5 反應溫度對收率的影響

2.2 正交試驗

根據單因素考察預實驗結果，選擇反應時間(A)、反應配比(B)、反應溫度(C)3個因素為考察因素，截取各因素3個水平，進行L9(34)正交試驗，因素及水平見表6，正交試驗見表7，方差分析結果見表8。

表6 因素水平

水平A(反應時間/h)B(反應溫度/℃)C(反應配比)14651∶128851∶1.23121001∶1.4

表7 正交實驗L9(34)結果分析

表8 方差分析

從表7正交實驗L9(34)結果分析得出：最優的組合為A2B2C3，即反應時間為8 h，反應配比為1∶1.2，反應溫度為85 ℃時產率最高。從表8方差分析可以看出：反應時間(A)、反應溫度(B)對產率有顯著的影響(P<0.05)，而反應配比(C)對產率影響相對不大。

2.3 實驗活性評價

通過正交試驗篩選的最佳合成路線得到的4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3 d)，其抗血小板聚集實驗活性要好于陽性對照阿司匹林IC50=37.38<42.96，數據統計見表9、10。

表9 阿司匹林對血小板聚集的影響

表10 阿司匹林對血小板聚集的影響

3 討論

根據單因素和正交試驗獲得的合成目標產物收率，確定了本工藝合成的最佳實驗條件：反應溶劑為DMF、反應時間為8 h、反應配比為1∶1.2、堿性環境為NaH、反應溫度為85 ℃。

本工藝方法比傳統方法收率更高，反應過程檢測及后處理變得簡單，同時原料易獲得。得到的川芎嗪衍生物的收率高達88%，比文獻報道的合成方法得到的產物收率提高了20%，實驗后處理不需要過濾分離，更節省時間，本實驗采用三溴化磷作為鹵化反應的親和試劑，而氯化亞砜有刺激性臭味反應劇烈，在使用氯化亞砜的過程中會生成大量HCl和SO2，對環境造成污染，同時氯化亞砜易發生水解反應，造成產率下降。因此，本合成工藝對環境污染很小。

抗血小板聚集實驗結果表明：本研究合成的川芎嗪衍生物具有抗血小板聚集作用且效果好于陽性對照阿司匹林。本研究合成的川芎嗪衍生物羧基在15位碳原子上，16位和17位羧基取代活性還需進一步研究；同時，血小板在制備的過程中，抗凝劑會對實驗分析產生誤差，防止血凝的方法還需要改進。