芽孢桿菌BLy的鑒定及抑菌活性物質特性

葉生梅,嚴 航，程其國

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

世界衛生組織發表文章呼吁應對全球耐藥感染問題，并援引英國經濟學家吉姆·奧尼爾(JimOnell)爵士發表的《全球抗菌素耐藥回顧》報告及建議指出，到2050年，抗菌素耐藥每年會導致1 000萬人死亡。如果任其發展，可累計造成100萬億美元的經濟損失。當前，所有的常規抗生素都出現了相應的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經日益嚴重地威脅著人們的健康。尋找和開發無毒、無副作用的新型抗菌物質是解決致病菌抗藥性問題的一條有效途徑[1-4]，而芽孢桿菌，特別是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌是一種在土壤和環境中常見的細菌，營養要求低，繁殖力強，能形成芽孢，抗逆性強；它們能夠調節動物微生態平衡、促進腸道有益菌生長、降低病原菌的數量,從而增加動物機體的抗病力和提高機體的免疫功能[5-6]。研究表明，芽孢桿菌能夠產生多種生物活性物質，包括蛋白酶、淀粉酶、抗菌蛋白、抗菌多肽類物質和一些小分子活性物質等,因此芽孢桿菌成為人們高度重視和研究的一類微生物[7-10]。

實驗室篩選到一株芽孢桿菌BLy，其對金黃色葡萄球菌具有顯著抑制作用。對菌株BLy進行鑒定，并研究抑菌物質的抗菌譜和有關性質，為進一步研究其抑菌物質的組成、結構及抑菌機理等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試菌株：芽孢桿菌BLy(BacillusBLy)，安徽工程大學微生物實驗室保藏。

抗菌活性測定指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、紅酵母(Rhodotorulasp.)、毛霉菌(Mucorsp.)、根霉菌(Rhizopussp.)、青霉菌(Penicilliumsp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)等，均由安徽工程大學微生物實驗室保藏。

1.2 試劑及儀器

試劑：酵母膏和蛋白胨(Oxoid公司)；TaqDNA聚合酶、dNTP(TaKaRa公司)；胰蛋白酶1∶250(豬胰)(滬試)；枯草桿菌蛋白酶10萬 U/g(MACKLIN)；蛋白酶K 20 mg/mL Solution(SANGON.COM)；葡聚糖凝膠G75(Sephadex G-75)；其他試劑均為國產分析純。

儀器：S1000PCR儀(BIO-RAD);GDS-8000 System凝膠成像系統(UVP Biolmaging systems);H-1850型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)；DYY-6D型電泳儀(北京六一儀器廠)；BM1000生物顯微鏡(江南永新光學)。

1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15～20 g(BL液體培養基不加瓊脂)，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，用于細菌的保藏和培養。

菌株BLy產抑菌物質發酵培養基LB液體培養基。

PDA培養基：按文獻[11]方法配置，用于真菌的保藏和培養。

1.4 菌株BLy的鑒定

(1)BLy的形態、生理生化特性測定。按照文獻[12]方法進行形態觀察實驗(菌落形態、革蘭氏染色、芽孢染色)及生理生化試驗(接觸酶試驗、V.P試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、蛋白質及碳源利用實驗等)。

(2)菌株BLy的16SrDNA基因測序及分析。BLy基因組DNA的提取采用文獻[11]方法，挑取BLy菌株的一個單菌落放入裝有LB液體培養基的試管中于37 ℃振蕩培養過夜(12～18 h)。培養液用于基因組DNA提取。16SrDNA基因的PCR擴增引物為通用引(F:AGAGTTTGATCATGGCTCAG;R:TAGGGTTACCTTGTTACGACTT)(上海生工合成)，反應體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μL；4種dNTP混合物(10 mmol/L)0.5 μL；上游引物(-F)(10 pmol/L)1.0 μL；下游引物(-R)(10 pmol/L)1.0 μL；模板DNA 0.8 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；無菌去離子水補加18.7 μL至反應體積25.0 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min后進入循環，94 ℃變性50s→52 ℃退火50s→72 ℃延伸2 min，共30個循環，最后一個循環為72 ℃延伸10 min。取5 μL反應液1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR擴增產物送交到上海生工生物工程股份有限公司進行DNA測序。將測序得到的堿基序列在NCBI核酸序列數據庫內進行BLAST序列比對，找出數據庫中與該菌株同源性較高的模式菌株。然后利用MEGA 5.1軟件對BLy菌株和其同源性菌株進行16SrDNA序列比對,并將比對結果用于系統發育樹的構建。

1.5 方法

(1)菌株BLy的種子培養和發酵。活化的BLy斜面菌種一環接種于裝有液體LB的三角燒瓶，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養12～18 h獲得菌株BLy種子液。吸取1 mL種子液轉接于裝有50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃、200 r/min培養，得發酵液。

(2)菌株Bly產抑菌物質的無菌發酵液的制備。取發酵液于10 000 r/min下，離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔過濾器過濾，得到無菌發酵液。

(3)抗菌活性測定指示菌的種子制備。取活化的各細菌菌種一環接種于裝有液體LB的三角燒瓶，37 ℃、200 r/min培養12～18 h獲得各細菌的種子液。霉菌的種子是孢子數1×105個/mL的孢子懸液。

(4)抗菌活性的測定。采取抑菌圈法[13],取0.1 mL指示菌的種子液于裝有20 mL滅菌的冷卻到約45 ℃的LB培養基，搖勻后倒入培養皿(直徑為9 cm)中，待凝固后利用無菌打孔器在培養基上打孔(直徑為5 mm)。吸取BLy的無菌發酵液于平板孔內，以無菌水作為空白對照，每個試樣三平行。37 ℃恒溫培養箱培養24 h，24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑的大小。用PDA培養基同樣方法測定抗真菌活性。

1.6 菌株BLy產抑菌物質的發酵過程

每隔2 h取一次BLy發酵液，以600 nm吸光度(OD600 nm)測定菌株的生長曲線。按1.5(2)方法制備無菌發酵液。以金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.5(4)抑菌圈法測定抑菌活性與培養時間的關系。

1.7 菌株BLy的抑菌物質的理化性質

(1)溫度對BLy抑菌物質活性的影響。將培養12 h的無菌上清液分裝于無菌試管中，分別置入50 ℃、80 ℃、100 ℃水浴鍋中保溫30 min，以不做任何處理無菌上清液為對照。處理后冷卻至室溫，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測量各樣液的抑菌活性。

(2)pH對BLy抑菌物質活性的影響。分別用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L的NaOH溶液將發酵液pH分別調為3.0～12.0，將樣液室溫保存過夜后用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液分別將各樣液pH值調回至7.0，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測量各無菌樣液的抑菌圈。

(3)水解酶對BLy抑菌物質活性影響。分別配制胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K，再將各酶液加入到裝有無菌上清液的試管中，使酶的終濃度分別是胰蛋白酶250 U/mL，枯草桿菌蛋白酶60 U/mL，蛋白酶K 60 U/mL，置于37 ℃下保溫1 h。以未處理的無菌發酵液作為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測量各樣液的抑菌圈。

1.8 拮抗物質的分離純化

(2)提取蛋白的色譜柱層析進一步分離。將葡聚糖凝膠G-75(Sephadex G-75)裝柱完成后，連接層析系統，用0.9% NaCl溶液作為洗脫液。洗脫液的流速為0.5 mL/min。分部收集洗脫流出液，5 min/管。核酸蛋白檢測儀調節為波長280 nm，記錄儀走紙速度設為2 mm/min。通過2～3 BV的洗脫液使柱床平衡。待層析柱平衡以后，將鹽析分離的混合蛋白質溶液緩慢地加入層析柱上端中央后立即用0.9%的NaCl溶液洗脫，觀察記錄儀的出峰情況。將出峰相應段的鄰試管中的液體合并。將不同峰段對應的蛋白質溶液取出編號，適度的濃縮后，經過0.22 μm的無菌過濾器過濾到無菌管內，吸取20 μL無菌處理液加入同一個接有金黃色葡萄球菌的平皿中做抑菌實驗，37 ℃下保溫24 h,測量各組分液的抑菌圈大小，對其抑菌活性進行評估，從而得出具有抑菌活性的物質位于哪個組分。

2 結果與分析

2.1 菌株BLy的鑒定

(1)形態和生理生化鑒定。菌株BLy菌落形態及染色觀察如圖1所示。由圖1a可知，菌株BLy菌落表面粗糙，乳白色,不透明，中間略有隆起，菌落邊緣向外擴展，不整齊，呈鋸齒狀。由圖1b可知，其液體震蕩培養呈渾濁分散狀態。該菌株革蘭氏染色陽性，桿狀，菌體單個或成對排列。由圖1c可知，芽孢桿狀，近中生，芽孢囊稍膨大。對菌株BLy進行生理生化特性試驗結果如表1所示。

從菌落形態、個體染色觀察和生理生化特性判斷，此菌株與《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)中的地衣芽孢桿菌比較接近，初步確定菌株BLy為地衣芽孢桿菌。

圖1 菌株BLy菌落形態及染色觀察

表1 菌株Bly形態學及生理生化特性

注：“+”表示陽性反應；“-”表示陰性反應

(2)菌株BLy 16SrDNA克隆及序列分析。用高滲法制備BLy菌株總DNA后，用制備的BLy菌株總DNA進行16SrDNA的PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行電泳檢測，結果表明，PCR擴增產物的片段長度在1 500 bp左右。

將BLy菌株的16SrDNA序列在NCBI核酸序列數據庫內進行BLAST同源性序列比對，根據序列比對結果，BLy菌株與地衣芽孢桿菌具有99%的同源性。利用MEGA 5.1軟件對所測定的BLy菌株與和它同源性最高的菌種的16SrDNA全序列進行遺傳距離計算，并根據遺傳距離得到了該菌株的系統發育進化樹如圖2所示。結合形態特征和生理生化指標，鑒定菌株BLy屬于地衣芽孢桿菌。

圖2 BLy菌株的系統發育樹

2.2 菌株BLy產抑菌物質發酵過程

測定不同時間的BLy菌發酵液的OD600 nm，以金黃色葡萄球菌為指示菌，每孔中加入15 μL BLy無菌發酵液，37 ℃培養24 h的抑菌圈，得到了BLy菌株產抑菌物質發酵過程曲線如圖3所示。從圖3分析可知，以LB培養基發酵，BLy菌株產抑菌物質的活性隨發酵時間而變化，在菌種的對數生長期抑菌物質積累最快，8～12 h抑菌物質增加緩慢，12 h抑菌活性達到最大，隨后下降。以LB為培養基，其產抑菌物質的合適發酵培養時間為10～12 h，可見BLy產抑菌物質的發酵周期與文獻[1]報道的24 h以及文獻[14]的48 h相比，發酵時間短，更易于生產和節約成本。15 μL BLy發酵10 h的無菌液與15 μL 10 U/mL青霉素對S.aureus的抑菌效果如圖4所示。由圖4可知，BLy對S.aureus抑制作用強，有進一步研究的價值。

圖3 菌株Bly生長曲線及產抑菌物質的發酵過程

圖4 BLy 10 h發酵液與10 U/mL青霉素對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.3 菌株BLy抑菌譜

通過抑菌圈法測定20 μL BLy菌株的發酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等的抑制作用。BLy的抗菌譜如表2所示。從表2中可以看出，BLy菌株的發酵液對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，對枯草芽孢桿菌有微弱的抑制作用，在試驗條件下對供試的其他菌株沒有抑制作用。由此可見，菌株BLy產生的抗菌物質是窄譜抗菌的，與文獻[15-16]中的廣譜抑菌報道的不同，說明其抑菌活性物質的組成及結構有不同特性，有待進一步研究。

表2 BLy的抗菌譜

菌種抑菌圈/mm金黃色葡萄球菌21.5枯草芽孢桿菌8.0大腸桿菌-啤酒酵母-紅酵母-

注：“-”表示沒有抑制作用

2.4 BLy產生的抑菌物質的理化性質

(1)溫度對抑菌活性的影響。將BLy培養12 h的菌液上清液除菌后60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴保溫30 min，冷卻到室溫取20 μL測定對S.aureus的抑菌活性。測定結果如表3所示。

(2)pH對抑菌活性的影響。研究中用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH調節發酵上清液的pH分別至3.0～12.0放置4 ℃過夜，再用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCL將pH調至7.0，0.22 μm過濾除菌，取20 μL除菌液測定對S.aureus的抑菌圈。測定結果如表3所示。

表3 溫度和pH對Bly發酵液抑菌作用的影響

(3)水解酶對抑菌活性的影響。發酵上清液中酶的終濃度分別是胰蛋白酶250 U/mL，枯草桿菌蛋白酶60 U/mL，蛋白酶K 60 U/mL，37 ℃反應1.0 h。用0.22 μm過濾除菌，取20 μL除菌液測定對S.aureus的抑菌圈。測定結果如表4所示。

表4 水解酶對Bly發酵液抑菌活性的影響

以上實驗結果表明，菌株BLy產生的抗菌活性成分能耐環境pH的變化，說明活性物質是具有酸堿兩性的電解質，具有一定的緩沖能力；而耐熱和抗水解酶等的作用說明抗菌活性成分不是大分子蛋白質類，綜合分析菌株BLy產生的抗菌活性物質可能是抗菌多肽(AMP)類。

2.5 Bly產生的抑菌物質的分離純化結果

菌株BLy發酵液中的拮抗物質經除菌體，硫酸銨鹽析，葡聚糖凝膠柱層析步驟分離后，拮抗物質的混合蛋白液葡聚糖凝膠G75(SephadexG-75)色譜層析結果如圖5所示。由圖5可知，從發酵液中提取的混合蛋白經Sephadex G-75層析分離以后，可粗略地分離為兩個組分(命名為δ1和δ2)，將兩個組分分別收集后做抑菌實驗，組分δ1沒有抑菌圈(為陰性“-”)，而組分δ2有抑菌圈(為陽性“+”)，說明具有抗菌活性的組分存在于分子量相對較小的δ2組分當中。

圖5 混合蛋白液色譜層析結果

3 討論

研究表明，菌株BLy在分類上屬于地衣芽孢桿菌，能產生對金黃色葡萄球菌具有強的抑制作用的活性物質；菌株利用LB培養基產抑菌物質，在菌株的對數生長期約10～12 h達到最大抑菌活性，比In-CheolYe[1]報道的24 h以及Nithyalakshmy Rajarajanbao[14]報道的48 h短；對BLy的抗菌譜測定表明其產生的抑菌物質對革蘭氏陽性菌作用效果比革蘭氏陰性菌好，且對供試真菌沒有抑菌作用。與高兆建[15]和李清[16]報道的廣譜抗菌不同，地衣芽孢桿菌BLy抗菌肽具有窄的抗菌譜,說明它的代謝產物有較好的選擇抗性,具有成為篩選具有選擇抗性的活性化合物的菌種資源的潛力；菌株BLy產生的抑菌活性物質具有較強的耐熱性能，100 ℃保溫30 min仍保持48.19%的抑菌性能，與In-Cheol Ye[1]報道的地衣芽孢桿菌100 ℃處理后失去抑菌活性不同。且耐環境pH、抗蛋白酶等水解酶的水解作用，說明具有抗菌活性成分，是分子量相對較小的組分，初步確定菌株BLy產生的抑菌活性物質為抗菌肽(AMP)。

隨著致病菌對抗生素耐藥性的不斷出現,研發新型抗菌藥物已迫在眉睫。抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內具備多生物活性的小分子多肽,是機體天然防御系統的重要組成部分，其獨特的抗菌機制使細菌不易對其產生耐藥性，從而倍受人們關注。從動、植物體內直接提取抗菌肽的難度大、工藝要求高，難以應用于規模化生產，并且對于某些高等生物或人類源而言抗菌肽難以實現。細菌中已發現的抗菌肽有bacitracin，polymyxinE，gramicidinS和nisin等4種類型，革蘭陰性菌或陽性菌均可分泌[3,17-18]。而細菌具有生長快、培養條件簡單、發酵周期短、短期內可獲得大量的代謝產物等優點。研究中的地衣芽孢桿菌BLy為具有益生作用的菌種，環境友好、易于培養、金黃色葡萄球菌在醫學臨床上是對青霉素等抗生素產生耐藥性的微生物。菌株BLy的抗菌肽對金黃色葡萄球菌具有特異性抑制，有一定研究價值。有關BLy產生的抗菌肽的進一步分離純化，抗菌活性物質的組成、結構及抗菌機理等有待進一步研究。