快速膨脹海藻酸鈉/二氧化硅纖維復合支架的制備及其快速止血功能的應用

舒華金，吳春萱，楊 康，劉廷武，李 晨，曹傳亮

(1 南昌大學醫院，南昌 330031；2 南昌大學第二臨床醫學院，南昌 330006；3 南昌大學 藥學院，南昌 330031；4 南昌大學第二附屬醫院，南昌 330006；5 南昌大學 機電工程學院，南昌 330031)

在交通事故、墜樓、醫院手術和戰場等情況下，失血過多是導致死亡最為主要的原因，因此迅速而高效地止血能夠挽救無數人的生命[1-2]。人體凝血過程分為兩步：初級止血過程和凝血級聯反應過程，其中凝血級聯反應過程主要是將血液轉化為纖維蛋白，從而實現止血。因此，止血是早期傷口愈合的第一步，具有非常重要的意義。然而，在沒有止血裝置和藥劑的幫助下，尤其是在緊急情況下，靠自身凝血作用并不能實現及時止血。在過去的幾十年里，最為常用的止血方式是傳統的止血繃帶和紗布，這些止血材料在表淺傷口和低出血量的傷口中表現出了一定的優勢，但面對深部創口，傳統止血材料由于難以觸及和較低的吸水性往往難以起效。針對這種情況，已開發出一些可填充在深部出血點并引發凝血過程的沸石[3-4]、止血粉[5-6]、膠原蛋白[7-8]和殼聚糖海綿[9-10]等。但是面對大出血時，沸石不僅容易進入毛細血管導致血栓形成，并且它們還具有吸水性和產熱的傾向，會對皮膚產生傷害；止血粉表現出弱的黏附性，容易被血液帶走；激發凝血過程的膠原或殼聚糖止血海綿在面對出血時往往需要一定時間來募集纖維蛋白和凝血因子，而且這種有機大分子物質通常表現出強的免疫排斥反應。因此，臨床上亟須開發新型生物相容性好且具有快速止血能力的海綿支架材料[11]。

靜電紡絲是制備多孔支架的一種綠色和常用的方法[12-13]，采用靜電紡絲法制備二氧化硅納米纖維支架因其優異的生物相容性和有利于細胞生長等特點被廣泛報道，但該方法制備的二氧化硅納米纖維絲脆性較大，不能具備良好膨脹性能，限制了其應用于止血海綿支架。海藻酸鹽敷料是一種已經被廣泛用于傷口愈合[14]、傷口止血[9]的支架材料，表現出優異的生物相容性和止血凝血性能，但是純海藻酸鈉敷料沒有堅韌的骨架作為支撐，強度低，仍未能應用于深部大傷口止血。近年，丁斌教授團隊報道了利用靜電紡絲技術與梯度冷凍法來制備高度多孔性支架的文章，具有孔率高、質量輕、韌性大等優勢，但并未研究其膨脹性及快速止血海綿的應用[15]。

本研究開發出一種具有高親水性和膨脹性，良好生物相容性的二氧化硅納米纖維，并使用海藻酸鈉(ALG)包覆在納米纖維上，以提高快速膨脹性能及促凝效果，對海藻酸鈉/二氧化硅纖維復合三維支架(ALG/SiO2止血海綿)的形貌和結構進行了表征。為制備出一種具有高膨脹性能快速止血性的復合傷口敷料，關鍵點是優化合成材料的配方，因此，本課題組將制備得到的ALG/SiO2止血海綿進行了鈣離子交聯，最終得到鈣離子交聯的海藻酸鹽包裹納米SiO2纖維的止血海綿(ALG/SiO2/Ca2+止血海綿)，而后對海綿的膨脹性及細胞毒性進行了研究，并采用兔股動脈出血實驗評估了該止血海綿的深部止血性能。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑

正硅酸乙酯(TEOS)、聚乙烯醇(PVA)、磷酸、海藻酸鈉(ALG)、氯化鈣、氯化鈉、淀粉和葡萄糖均購自上海麥克林生物化學有限公司。胰酶和培養基(1640)購自北京索普迪奧科技有限公司。

1.2 止血海綿的制備

將10.7mL的正硅酸乙酯(TEOS)與0.042mL的磷酸溶液和10mL的超純水混合，在室溫下攪拌反應12h后加入20mL 10%(質量分數，下同)的聚乙烯醇(PVA)溶液，進一步攪拌12h，室溫陳化，制得紡絲液。然后在紡絲電壓為25kV和流速為1mL/h的條件下通過自制的靜電紡絲裝置進行靜電紡絲，得到PVA/TEOS納米纖維，將其在800℃下進行煅燒，制備出純的SiO2納米纖維。將0.9g的SiO2納米纖維添加到300mL 1.5%的海藻酸鈉溶液中，并在12000r/min的轉速下高速剪切30min，將所得的分散體在干冰/丙酮浴中梯度凍結后，冷凍干燥12h獲得海藻酸納包裹SiO2纖維支架(也即ALG/SiO2止血海綿)。最后將ALG/SiO2止血海綿浸泡在0.3mol/L CaCl2溶液中10min，取出后冷凍干燥48h，最終得到ALG/SiO2/Ca2+止血海綿。

1.3 材料的表征

利用SU8000型掃描電子顯微鏡對制備的SiO2納米纖維、經海藻酸鈉和氯化鈣交聯后的海綿進行表征，并通過EDS對所得纖維和海綿的元素含量與分布進行測定。設計了海綿的吸水膨脹實驗，將海綿在水中壓縮，其中V1為浸入水后海綿的體積，V0為海綿的原始體積。體積膨脹率(%)=V1/V0×100%。

1.4 細胞毒性實驗

采用CCK-8法評估材料的細胞毒性。在37℃ SPX-250型培養箱中用無血清細胞培養基浸泡24h，得到ALG/SiO2/Ca2+止血海綿浸提液。從培養箱中取出已經培養到一定細胞密度的L929細胞培養瓶，以每孔3×103Cells/L的濃度接種L929細胞到96孔板后，震蕩混勻并放入培養箱中，在培養箱中培養24h后，每孔加入100μL PBS洗滌細胞及100μL不同濃度的浸提液，放入培養箱中繼續培養。每兩天更換一次培養基，在第1天，第3天，第7天提前2h加入10μL CCK-8試劑，最后用酶標儀(吸光度：450nm)測其OD值。

1.5 死活細胞染色

從培養箱中取出已經培養到一定細胞密度的L929細胞培養瓶，以每孔4×103Cells/L的濃度接種L929細胞到24孔板后，震蕩混勻并放入培養箱中，在培養箱中培養24h后，每孔加入100μL PBS洗滌細胞，再加入100μL不同濃度的浸提液，放入培養箱中繼續培養。分別在培養的第1天，第3天，第7天時加入死活細胞染液，然后放入37℃培養箱孵育30min，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 體內止血實驗

選取6只新西蘭大白兔(南昌大學動物中心)，分為ALG/SiO2/Ca2+止血海綿組和加壓紗布組，每組3只。手術中在左側股三角區域腹股溝內1/3與外2/3交點處摸到股動脈，觸及股動脈搏動后，沿動脈行走方向做長約2cm的切口，游離股動脈，剪斷。然后立即將止血材料壓進創口內部，并記錄相應時刻止血效果圖片。

2 結果與分析

2.1 SiO2纖維和ALG/SiO2/Ca2+海綿的微觀結構分析

圖1(a)是SiO2納米纖維的掃描電子顯微鏡照片，顯示了平均直徑約為200nm均勻分布的SiO2納米纖維，說明煅燒后的納米纖維表面較光滑，粗細較均勻。在SiO2納米纖維的靜電紡絲過程中可以通過控制電壓、PVA含量、流速和電導率得到不同直徑的納米纖維，在以往的研究中表明，提高電壓、增大電導率、降低流速和減小黏度可以減小納米纖維直徑，增大電導率可以提高納米纖維的孔隙率。圖1(b)是ALG/SiO2/Ca2+海綿的掃描電子顯微鏡照片，表明ALG/SiO2/Ca2+海綿具有高度疏松的多孔結構，有利于海綿的止血。由圖1可知ALG/SiO2/Ca2+海綿的離子交聯過程并沒有破壞支架的多孔結構，雖然觀察到在海綿的制備過程中部分二氧化硅納米纖維發生了斷裂，但互相交聯的海藻酸鈉彌補了斷裂的二氧化硅之間的連接。ALG/SiO2/Ca2+海綿的這種疏松的蜂窩狀多孔結構用做止血海綿在快速止血方面是非常重要的，可以迅速吸收大量的傷口分泌物，從而使傷口處的血漿濃度增加，除此之外，高度親水性的多孔結構還可以使傷口處保持濕潤狀態，有利于傷口的愈合。

圖1 SiO2納米纖維(a)和ALG/SiO2/Ca2+海綿(b)的SEM圖Fig.1 SEM images of SiO2 nanofiber (a) and ALG/SiO2/Ca2+ sponge (b)

圖2是SiO2納米纖維支架和ALG/SiO2/Ca2+復合支架的面掃描圖和元素全分析能譜圖，結果顯示支架均以SiO2納米纖維為主要骨架，其中SiO2納米纖維支架O和Si元素分布完全相同，且與掃描電鏡的形貌吻合，說明支架為純的SiO2納米纖維，元素全分析顯示除了O和Si的峰外，僅有少量的C元素，進一步證實了支架為SiO2納米纖維支架。ALG/SiO2/Ca2+海綿的元素分析光譜(圖2(f))顯示O和Si元素分布也基本一致，說明了海藻酸鈉均勻地包裹在SiO2納米纖維表面，元素分析發現了C，O，Si，Cl和Ca的峰值，可推知Ca2+交聯劑成功地被負載到ALG/SiO2/Ca2+止血海綿上。

圖2 SiO2納米纖維(a),(b),(c)和ALG/SiO2/Ca2+海綿(d),(e),(f)的能量色散X射線圖譜Fig.2 EDX images of SiO2 nanofiber (a),(b)，(c) and ALG/SiO2/Ca2+ sponge (d),(e)，(f)

在深部止血過程中，海綿的吸水膨脹是海綿激發的一系列物理-生化止血過程的第一步，即通過膨脹帶來的壓力壓迫血管，達到初步止血目的。因此，海綿的吸水膨脹特性對實現其止血功能具有重要意義。ALG/SiO2/Ca2+海綿的溶脹性能測試實驗結果如圖3所示。圖3(a)直觀展示了海綿的快速溶脹性，將壓縮后的ALG/SiO2/Ca2+海綿支架，加入水后10s內完成膨脹過程，體積增大到原來的219%。盡管其溶脹的倍數仍有待進一步提升，但其溶脹速率非常快，10s內達到最大膨脹倍數，這對于快速止血與挽救生命來說是一個相當重要的指標。因為支架的快速膨脹性會對獨立的出血血管產生一個瞬時壓迫力，另外支架的高溶脹性也可以用于從血清中有效地吸收水分以濃聚凝血因子和紅細胞以阻止血液的流出，從而在短時間內對傷口起到封閉作用以減少出血量。

圖3 ALG/SiO2/Ca2+海綿的溶脹性能測試結果(a)體積膨脹示意圖；(b)體積膨脹率隨時間關系曲線Fig.3 Results of water absorption expansion test of ALG/SiO2/Ca2+ sponge (a)schematic diagram of volume expansion;(b)curve of volume expansion ratio versus time

2.2 細胞毒性實驗和死活細胞染色

生物醫學材料首先的要求就是其對人體無毒害作用[16]。采用CCK-8法和死活細胞染色來測試ALG/SiO2/Ca2+海綿對L929細胞增殖的影響，結果見圖4。圖4(a)是ALG/SiO2/Ca2+海綿的細胞毒性測試結果，由圖可知吸光度值之間沒有顯著的差異。如圖4(b)所示，在第1,3,7天，細胞的數量逐漸增多并且ALG/SiO2/Ca2+海綿的浸提液并沒有對細胞產生任何的負面作用，說明ALG/SiO2/Ca2+海綿沒有生物毒性，并且具有較好的細胞相容性。

圖4 ALG/SiO2/Ca2+海綿的細胞實驗結果 (a)海綿浸提液對細胞增殖的影響；(b)海綿的死活細胞染色熒光顯微鏡圖(control表示用細胞培養基(DMEM)培養的細胞作為對照組)Fig.4 Cell experiment results of ALG/SiO2/Ca2+sponge(a)effect of sponge extract on cell proliferation;(b)fluorescence microscopy image of live/dead cell staining of ALG/SiO2/Ca2+ sponge (control indicates that cells cultured with cell culture medium (DMEM) is served as a control group)

2.3 體內止血實驗

為了進一步貼近實際中可能的情況，如圖5所示，本課題組設計了家兔股動脈出血實驗以模仿實際情況中可能出現的大出血。手術中在左側股三角區域腹股溝內1/3與外2/3交點處摸到股動脈，觸及股動脈搏動后，沿動脈行走方向做長約2cm的切口，游離股動脈，剪斷。之后立即使用ALG/SiO2/Ca2+海綿進行止血，對照組采用傳統的醫用紗布進行止血，每組3只，以降低實驗誤差。實驗組使用止血海綿的止血效果如圖5(d)～(f)所示，出血均可在10s內被遏制。然而，當用加壓紗布法進行常規止血時(如圖5(a)～(c)所示)，無法有效止血，出血時間超過120s。ALG/SiO2/Ca2+海綿之所以可以快速止血，是因為ALG/SiO2/Ca2+海綿能迅速從血液中吸收大量水分并且膨脹可以對出血血管產生一個瞬時壓迫力從而防止血液外流。同時，溶脹的海綿可在短時間內封閉傷口，以減少出血量并降低感染風險。因此，ALG/SiO2/Ca2+海綿的溶脹膨脹特性對目前的止血支架具有重要意義。

3 結論

(1)采用靜電紡絲工藝加高溫煅燒得到二氧化硅納米纖維，并以它為骨架表面附著海藻酸鈉，然后用鈣離子交聯，通過冷凍干燥技術，最終得到結構疏松多孔的ALG/SiO2/Ca2+海綿。

(2)ALG/SiO2/Ca2+海綿吸水膨脹性好，能在10s內達到最大體積，且具有良好的生物相容性，在深部創口中能迅速吸水膨脹，壓迫血管，封閉傷口，促進血液的快速凝結，相比傳統紗布止血效果明顯。

(3)基于ALG/SiO2/Ca2+海綿良好的止血效果，設想結合細胞種植或添加其他活性物質如各種生長因子等，可以進一步拓展其應用范圍，為以后尋找新型止血敷料提供了新的思路。