針灸透刺鶴頂與內膝眼穴對兔膝關節炎軟骨細胞免疫微環境調控的影響

張翠洲，劉 淵，張二尹，張嚴勻，張藝馨

廣西中醫藥大學(南寧 530001)

膝骨性關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)病變部位主要涉及膝關節軟骨、軟骨下骨以及滑膜組織等[1]，是中老年人常見病和多發病，臨床上主要表現為關節疼痛、關節變形、僵硬腫脹等為主，嚴重影響患者的生活質量，雖然目前中西醫治療各有優勢，但很難徹底解決本病軟骨細胞凋亡的病理改變[2]，近年來有學者進行多方面研究發現在退變的膝骨關節炎的關節液中，大量的免疫細胞及炎癥因子參與病變過程，與病情的嚴重程度成正相關[3]，因此在研究軟骨細胞凋亡和力學改變的基礎上，更多學者將研究骨關節炎的目光投入到機體免疫炎癥方面，對炎性因子與膝關節軟骨代謝標志物水平的影響作了相關報道[4]。近年來，研究報道[5-6]針灸穴位治療KOA具有較好的臨床療效，作為一種安全無副作用的治療方法備受肯定。筆者在臨床實踐中運用針灸透刺鶴頂與內膝眼穴治療KOA，取得較滿意的臨床療效，但對其治療機理尚不清楚，因此本課題研究是否通過透刺鶴頂與內膝眼穴調節膝關節免疫微環境而達到治療目的進行了研究，從而為推廣臨床治療提供理論依據。

材料和方法

1 材 料

1.1 動物：選取健康4～6月齡雌性新西蘭白兔24只，體質量(2.05±0.1) kg，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(桂)2003-0001。飼養于廣西中醫藥大學實驗動物房，飼養溫度18℃～22℃，濕度45%～55%，自由飲食。

1.2 藥物與試劑：木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸，購于美國Sigma公司、0.9%的生理鹽、1%戊巴比妥鈉、兔IL-6、TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13試劑盒由美國San Diego公司提供，對物品的操作過程嚴格按照說明書進行。

1.3 主要儀器：酶標儀、Western blot檢測儀、低溫冰箱及便攜式標本貯藏罐等，關節量尺、關節角度測量儀。

1.4 造模試劑的配置：2%木瓜蛋白酶和0.03mol/L L-半胱氨酸混合液配制，充分溶解和攪拌均勻，在無菌條件下用0.22μm濾膜過濾去除未溶解的雜質，靜置30 min后待用[7]。

2 實驗方法

2.1 造模方法：將24只新西蘭兔隨機分為A、B、C三組，A組不做任何處理，B、C組于造模前1 h配制2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液，于實驗的第1、4、7天向兔子右膝關節內注入混合液0.5 ml。具體方法：將兔子固定于兔臺上，刮除右膝關節部位兔毛，用75%乙醇消毒后在髕韌帶附著點外上方約0.5 cm處進針注入造模劑混懸液。針頭刺入關節腔內有落空感后回抽無血性液體，注入0.5 ml混合液，活動兔膝關節使混合液充分分布在關節內[8]。術后連用3天青霉素鈉(國藥準字H37021950)5萬單位/(kg·d)，于造模1周后開始實驗。

2.2 實驗治療：A組為正常對照組給予生理鹽水灌胃，灌胃量為2 ml/100g；B組為造模組，生理鹽水灌胃，灌胃量為2 ml/100g，兩組均為1次/d灌胃，持續4周；C組給予針灸透刺鶴頂至內膝眼穴位1次/d，20 min/次，持續4周。所有動物單籠飼養，4周末分別處死所有動物。

3 指標測定 治療結束后首先進行關節行為學檢測，膝關節的疼痛、步態、關節活動度及關節腫脹指標，采用關節測量儀和關節尺檢測并記錄，其后抽取各組兔耳緣靜脈血，離心后用ELISA檢測血清IL-6表達水平；最后處死實驗各組兔，取關節組織勻漿，提取蛋白，BCA法蛋白定量，調整蛋白濃度。Western blot分析目的蛋白TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13的表達水平。

4 統計學方法 統計分析采用SPSS 22.0統計學軟件處理，各組之間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 ELISA血清IL-6檢測 血清結果顯示C組檢測指標IL-6與A組相比較略高，但兩者比較無統計學差異(P>0.05)；而B組血清IL-6水平高于其它兩組，三者比較有統計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 三組血清IL-6水平(ng/L)

2 Western blot檢測TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13表達情況 C組檢測指標TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13與A組各對應指標比較無統計學差異(P>0.05)，而B組TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13各項指標均高于C組，兩者各指標相互比較有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 三組Western blot檢測目的蛋白灰度值

3 行為學觀察結果 在治療結束后采用改良Lequesne MG評估方法對各組家兔膝關節的疼痛、步態、關節活動度及關節腫脹等行為學指標，進行計分評價，并計算結果總分差值進行統計學分析。結果B組4項各評分明顯上升，與A和C組相比三組均有統計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 三組行為學各項檢查結果(分)

討 論

膝骨性關節炎是一種臨床上較為常見的膝關節退行性病理改變，發于老年人當中，輕癥患者可見膝關節處明顯疼痛，以及活動受限等臨床表現，重癥時可致患者發生慢性殘疾[9]，嚴重影響患者的生命質量等特點[10]，目前針對本病治療主要以減輕疼痛，緩解軟骨退變等為主，隨著研究的多樣性和不斷深入，除軟骨退變外，機體免疫炎癥對膝關節局部微環境產生的影響也正在被越來越多的學者關注[11]。研究發現，膝關節局部產生炎癥介質是導致關節軟骨退變和滑膜細胞活化的原因之一，與健康人對比，KOA患者的血清中某些炎癥介質的水平明顯升高[12]，而KOA關節液中的蛋白可導致巨噬細胞通過TLR4信號通路產生炎癥因子[13]，同時關節組織中高度浸潤的T淋巴細胞釋放大量炎癥因子，這些炎癥因子可增強微環境的免疫反應而促使軟骨基質進一步破壞，因此在研究膝骨關節炎的病理機制時，應不單從軟骨蛻變研究，更要研究免疫微環境的改變對KOA的病變機制的影響。

在前期的研究中[14]，我們已經發現和證實膝骨關節炎的發生與細胞CTX-Ⅱ和COMP存在密切的關聯性，多指標聯合應用能大大提高膝骨關節炎的診斷準確性，在膝骨關節炎的發病中具有重要的作用，并且可以反映病情和證型的變化，這為本次研究提供了較堅實的實驗依據。同時近年來的研究發現[15]，結合骨生物學與骨免疫學研究，可以更好地揭示免疫系統和骨關節系統的密切聯系，深入研究免疫細胞在骨相關疾病的生理病理過程中發揮了重要作用是目前研究的一個趨勢。據研究報道[16]，炎性病變與TLRs信號通路在膝骨關節炎的發揮著重要的作用，Toll樣受體(TLRs)做為模式受體之一，當膝骨關節受到炎性損傷時，會激活TLRs信號通路，使TLR相關受體(TLR3、TLR4、TLR7)與髓樣細胞分化因子(MyD88)結合，從而激活下游信號轉錄因子NF-κB，而這兩者均屬于固有免疫的模式識別受體(PRR)，從而產生天然免疫激活程序，調控IL-6、TNF-α、MMP-13等重要炎癥因子，抑制炎癥反應，這些研究為本次開展相關研究提供了理論和實驗基礎。

KOA屬中醫學“痹證”、“骨痹”范疇[17]，主要由老年人機體肝腎不足、氣血虧虛，加之風邪寒濕入體等綜合原因而引發本病，表現為本虛標實，不通則痛的病理機制。因此本病的治療應以改善局部血供、調理經脈、開阻除痹、活血通絡為主[18]。本病屬于慢性遷延性疾病，中醫治療以中藥內服外用、針灸推拿等為主，尤其擅長慢性勞損性疾病的治療，治療效果較好，并且安全性高，毒副作用小。其中針灸治療本病療效明確、操作便捷、創傷小且無毒副作用，為臨床治療膝骨關節炎常用方式。賀小卉[19]用不同針灸方式治療虛寒型膝骨關節炎患者162例，觀察骨性關節炎指數(WOMAC)評分及疼痛癥狀，觀察組顯效率是62.96%，總有效率是98.77%，均分別明顯高于對照組的46.91%及90.12%，認為利用溫針灸治療KOA患者可產生較好的療效。目前研究大多數學者從溫通角度出發[20]，取得了滿意的臨床療效，而在臨床運用中，我們發現通過透刺針法治療KOA，患者也能取得較滿意的療效，尤其是選取經外奇穴內膝穴和鶴頂穴時，療效顯著。內膝穴和鶴頂穴位于膝關節內上側，均屬經外奇穴，均主膝痛，足脛無力，鶴膝風等病癥，尤其是對于早中期KOA的治療有明顯的效果，但缺少明確的治療機制研究和報道。目前針灸治療本病分為針刺、溫針灸、火針、電針、浮針等，《素問·痹論》載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也” 。痹證是指風、寒、濕、熱之邪侵襲人體經絡，導致氣血不通，經脈閉塞所引起的病證，臨床表現多為關節疼痛，活動障礙，酸軟無力，關節畸形等，目前研究表明[21]，針灸不僅能夠提高免疫細胞如淋巴細胞、中性粒細胞、單核巨噬細胞、NK細胞等的數量、活性及功能，還能通過減少損傷性細胞因子，增加保護性細胞因子，免疫球蛋白及補體等增強機體的免疫功能，且能延緩免疫器官的萎縮和功能退化[22-25]。

因而本次課題研究從免疫學TLRs信號通路為切入點，建立兔膝關節炎模型，運用現代醫學研究手段進行針灸透刺穴位治療膝骨關節炎的動物研究。結果研究發現運用針灸透刺鶴頂至內膝穴，可以明顯改善兔膝關節的的疼痛、步態、關節活動度及關節腫脹等行為學指標，與模型組比較差異具有統計學意義，這表明透刺穴位有利于膝關節經絡的疏通，起到疏經通絡并調和氣血的治療效果。進一步抽取血清學和關節軟組織提取檢查，發現血清IL-6在C組較B組明顯降低，兩者比較差異具有統計學意義，與此同時關節組織的免疫學TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13檢測也同血清學檢測相一致。這充分說明運用透刺鶴頂至內膝穴可以從內改善關節免疫炎癥，同時改善關節的各項力學指標，還可利于膝關節血管的擴張，并加速血液循環，緩解或消除因關節損傷而導致的炎癥，最終發揮了消腫止痛和散寒通絡之功效。

此次研究證實了臨床運用此透刺手法治療膝骨關節炎確實有效，并且通過研究表明，膝骨關節炎不僅是軟骨退變性疾病，其免疫學的改變和參與也應當得到重視。同時為臨床運用此法治療KOA和后期進一步利用細胞分子、生化等檢測技術更深一層探討具體信號通路及效應的作用機制奠定基礎。