桃紅四物湯對CCl4誘導肝纖維化小鼠治療作用及其機制研究

邱 勇

三峽大學中醫醫院(宜昌市中醫醫院)(宜昌 443000)

肝纖維化是由各種致病因素引起肝細胞損傷，導致肝內結締組織異常增生并相對可逆的病理改變過程，是各種慢性肝病進展為肝硬化的前期階段[1-2]。因此，在該階段進行干預治療，對肝硬化的防治具有重要意義[3]。中醫藥在對肝纖維化的治療中有明顯的優勢，主要以活血化瘀為主。其中，桃紅四物湯在臨床上廣泛應用于肝纖維化患者，具有良好的療效[4-5]。在此基礎上，本實驗從動物水平探討桃紅四物湯對肝纖維化的影響及可能存在的作用機制。

材料和方法

1 實驗動物 健康昆明小鼠50只，雌雄各半，體重18 ～ 22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2012-0001。

2 實驗藥物 桃紅四物湯由熟地12 g，白芍、當歸、桃仁各9 g，川芎、紅花各6 g組成，實驗藥材均購于老百姓大藥房。按上述比例進行稱量藥物，并按傳統方法將中藥浸泡，武火煮沸，文火煎2次，去渣并合并濃縮至1 g/ml浸膏備用。秋水仙堿片(國藥準字H53021369，規格：0.5 mg/片)。

3 實驗試劑 CCl4(無錫市展望化工試劑有限公司，批號450105)；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ試劑盒均購于上海研晶生物科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒購于博士德生物工程有限公司。

4 實驗儀器 電子天平(德國Sartorius)，T18勻漿機(德國IKA集團)，低速臺式離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

5 動物分組及給藥方法 隨機取10只小鼠為正常對照組，余40只小鼠按參考相關文獻[6- 7]，采用30%CCl4花生油溶液按1 μl/g腹腔注射進行造模，2次/周，共8周，正常對照組腹腔注射等劑量的花生油。造模完成后再隨機分為模型組、秋水仙堿組(1 mg/kg)、桃紅四物湯低、高劑量組(4.25 g/kg，17 g/kg)，每組10只。造模后各組按劑量灌胃給藥，1 d1次，連續給藥6周，正常對照組及模型組予以等容量蒸餾水灌胃。末次給藥后予以禁食不禁水，24 h后予以3%水合氯醛麻醉后心臟采血，并取出肝臟備用。

6 檢測指標

6.1 血清指標檢測:小鼠麻醉后用普通抗凝管心臟采血，后以3000 r/min離心5 min，取上清，按試劑盒說明檢測小鼠ALT、AST；取左葉肝臟加生理鹽水制作10%肝組織勻漿液，2500 r/min離心10 min，取上清，按試劑說明進行檢測HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、SOD、MDA、GSH-PX。

6.2 病理組織學檢測:用4%多聚甲醛固定小鼠肝右葉組織，常規石蠟包埋，切片，HE染色，脫水，封片后光鏡下觀察肝臟組織學改變。

結 果

1 桃紅四物湯對各組小鼠血清ALT、AST活性的影響 結果如表1所示，CCl4造模后，ALT、AST活性顯著升高(P<0.01)。治療后，秋水仙堿組及桃紅四物湯低、高劑量組的ALT、AST活性均顯著降低(P<0.01)。

表1 桃紅四物湯對各組小鼠血清ALT、AST的影響(U/L)

注：與正常對照組相比，△P<0.01；與模型組相比，◇P<0.01

2 桃紅四物湯對小鼠血清肝纖維化指標的影響 結果表明，正常組與模型組相比，模型組HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，秋水仙堿組及桃紅四物湯高劑量組HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量明顯降低(P<0.05)；桃紅四物湯低劑量組中HA、PC-Ⅲ的含量改變不明顯(P>0.05)，LN、C-Ⅳ含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 桃紅四物湯對小鼠肝臟病理組織學的影響 常規肝組織HE染色可見，正常對照組肝小葉結構及肝細胞正常，無膠原纖維增生或炎癥浸潤。模型組可見肝小葉結構不清，部分肝細胞彌漫性水腫、壞死及脂肪變性，伴有炎性細胞浸潤，匯管區可見大量纖維組織增生，假小葉形成。與模型組相比，秋水仙堿組及桃紅四物湯低、高劑量組各組肝小葉結構破壞程度降低，肝細胞水腫、壞死、變性及炎癥浸潤也減少，纖維組織增生及假小葉也得到改善(圖1)。

4 桃紅四物湯對小鼠肝組織內SOD、MDA、GSH-PX含量的影響 由表3可知，CCl4造模后，模型組SOD、GSH-PX明顯降低(P<0.01)，MDA明顯升高(P<0.01)，經治療后，秋水仙堿及桃紅四物湯高劑量組SOD、GSH-PX含量均顯著上升(P<0.01)，MDA顯著下降(P<0.01)；桃紅四物湯低劑量組SOD、MDA改變不明顯(P>0.05)，但GSH-PX含量明顯上升(P<0.01)。

表2 桃紅四物湯對小鼠血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的影響

注： 與正常對照組相比，△P<0.01；與模型組相比,◇P<0.01，▲P<0.05

A：正常對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：桃紅四物湯低劑量組；E：桃紅四物湯高劑量組

表3 桃紅四物湯對小鼠肝組織內SOD、MDA、GSH-PX含量的影響

注：與正常對照組相比，△P<0.01；與模型組相比，◇P<0.01,▲P<0.05

討 論

肝纖維化的病因很復雜，常見的主要有肝炎病毒、酒精、藥物、毒物、血吸蟲、免疫炎癥等多種因素長期損傷引起，是進展為肝硬化及肝癌的必經之路[8]。肝纖維化的發生發展是一個復雜的全身性的病理生理過程，涉及多種細胞因子及信號通路，目前認為，肝臟受損后，肝內Kupffer細胞被激活，分泌細胞因子，這些因子可活化肝星狀細胞(HSC)，使其轉化為肌成纖維細胞，并與多種因子結合，分泌大量細胞外基質成分，由于細胞外基質成分不斷產生、沉淀，遂身體發生了肝纖維化[9-10]。

中醫學認為，肝纖維化多屬于“脅痛”、“黃疸”、“癥瘕”、“痞滿”、“積聚”等范疇，多由濕熱毒邪內侵，導致肝氣郁滯，脾虛不運，日久氣虛血瘀，進而損傷肝腎之陰，最終導致正虛血瘀[11-12]。桃紅四物湯是在四物湯的基礎上加桃仁、紅花而成，是活血養血之代表方。方中桃仁、紅花、川芎、當歸等單味藥均表明有抗肝纖維化作用[13]，臨床研究發現該方對肝纖維化等肝臟疾病也具有良好的治療效果[4-5]。本研究表明，桃紅四物湯可明顯降低CCl4誘導肝纖維模型中ALT、AST的含量，減少HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的釋放，并能降低肝小葉結構破壞程度，減少肝細胞水腫、壞死、變性及炎癥浸潤，改善纖維組織增生及假小葉形成，具有明顯的護肝作用。

SOD能有效地清除活性氧和自由基，是體內主要的抗氧化防御活性物質；GSH-PX為分解氫過氧化物所必須的物質，其含量多少是衡量機體抗氧化能力的重要因素；MDA 是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，可間接反映機體的自由基代謝變化及細胞的損傷程度。桃紅四物湯可提高CCl4誘導小鼠肝纖維化肝組織勻漿中SOD、GSH-PX的活性，降低MDA的水平。提示桃紅四物湯可以提高機體抗氧化能力，清除活性氧和自由基，抑制脂質過氧反應，從而發揮對肝臟的保護作用。

綜上所述，桃紅四物湯對CCl4誘導肝纖維化模型具有保護作用，其保護作用機制可能是通過提高肝臟抗氧化的能力，降低脂質過氧反應實現的。