甲醛對鯽血清抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

任海，張諾，華智杰，梅靜，梁俊平，李雪冬

（1.河北科技師范學院動物科技學院，河北 昌黎 066600；2.河南師范大學水產學院，河南 新鄉 453007；3.秦皇島市國家級水產種質資源保護區管理處，河北 秦皇島 066000）

甲醛（HCHO）是一種具有強烈刺激性氣味的氣體，易溶入水，通常將40%的甲醛水溶液稱為福爾馬林。甲醛能與機體內的蛋白質發生反應，還能與細胞質結合而殺滅細菌、寄生蟲、真菌、芽孢和病毒等，是水產養殖中常用的化學藥物[1]，尤其是寄生蟲疾病的防治中。甲醛毒性強，副作用較大，對魚類有明顯的負面影響，表現為：不安亂竄，浮頭，鰓損傷，身體側翻失去平衡，甚至死亡[2]。

甲醛治療魚類寄生蟲病時，對機體抗氧化系統機能的影響尚未見報道。魚類具有完善的抗氧化系統，用于抵御外界氧化脅迫因子產生的活性氧自由基[3]。當體內活性氧自由基量增加時，機體的抗氧化系統相應抗氧化酶的活性受到影響[4]。抗氧化酶活力的變化在一定程度上能反映魚類在不同環境條件下的生理狀況，可作為衡量魚類是否受到外界環境脅迫的重要生理指標，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化酶類在免疫調節中發揮重要的作用[5-7]，而丙二醛（MDA）作為機體脂質過氧化作用的終產物，其含量高低可間接反映機體的脂質過氧化水平以及生物細胞受活性氧自由基攻擊的程度[8]。本研究通過測定用不同濃度甲醛處理后鯽Carassius auratus 血清中SOD、CAT、GSH 活力和MDA 含量變化，以探討鯽抗氧化系統對甲醛脅迫后的響應。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鯽購自昌黎縣碣陽湖，平均體質量為（500±25）g，暫養一周后，選規格相近、無病無傷的健康個體進行試驗。

主要儀器：水族箱（70cm×20cm×30cm）、電子天平、臺式高速離心機、恒溫水浴鍋、酶標儀等。

主要試劑：甲醛（分析純，含量為40.0%）購自天津市風船化學試劑科技有限公司；測定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量的試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

試驗用水為充分曝氣的自來水，pH 為（7.0±0.2），溫度為（20±2）℃。鯽隨機分為對照組（不添加甲醛）和試驗組，每組設3 個平行，每個平行4 尾。將甲醛溶液于1 000mL 燒杯中稀釋后潑灑到水族箱內，使箱內水體中甲醛終濃度為50mg/L 和100mg/L。試驗期間持續充氧，觀察鯽的活力。潑灑甲醛后1h、3h 和6h 隨機從每個魚缸內撈取1 尾魚，尾靜脈采血，合并3 尾魚血液于1.5mL 離心管中，4℃冰箱放置6h 后3 000r/min（4℃）離心10min，收集血清，保存在-20℃冰箱中備用。

CAT、SOD 和GSH 活性及MDA 含量按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說明書進行測定。每min 分解1μmol 的過氧化氫即為1 個酶活力單位（U）。每mg 組織蛋白在1mL 反應液中SOD 抑制率達50%時所對應的SOD 量為1 個SOD 活力單位（U）；用5，5'-二硫代硝基苯甲酸（DTNB）比色法測定GSH 活性；采用TBA 法測定MDA 含量。

1.3 數據分析

所有指標測定均重復3 次，試驗數據用Microsoft Excel 2003 處理后，用平均值±標準差（mean±SD）表示，利用SPSS 20.0 統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），經Duncan's 檢驗法進行統計分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 甲醛對鯽血清SOD 活力的影響

由圖1 可知，不同甲醛濃度（50mg/L 和100mg/L）浸泡鯽1～6h，隨著甲醛脅迫時間的延長，試驗組鯽血清中SOD 活力先升高后降低，在3h 達最大值，之后有所下降，但是，在整個過程中SOD 活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖1 甲醛對鯽血清SOD 活力的影響Fig.1 Effect of formaldehyde exposure on SOD activity in serum of crucian carp

2.2 甲醛對鯽血清CAT 活力的影響

由圖2 可知，隨著甲醛脅迫時間的延長，試驗組鯽血清中CAT 活力先升高后下降，3h 達最大值。50mg/L 甲醛處理組1h 血清中CAT 活力顯著低于對照組（P＜0.05）；而50mg/L 和100mg/L 甲醛處理組3h和6h 血清中CAT 活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3 甲醛對鯽血清GSH 活性的影響

圖2 甲醛對鯽血清CAT 活力的影響Fig.2 Effect of formaldehyde exposure on CAT activity in serum of crucian carp

圖3 甲醛處理對鯽血清GSH 活力的影響Fig.3 Effects of formaldehyde exposure on GSH activity in serum of crucian carp

由圖3 可知，不同濃度甲醛浸泡6h 后，隨著甲醛處理時間的延長，鯽血清中GSH 活力先升高后降低，3h 時達最高值。50mg/L 和100mg/L 甲醛處理1h和6h 后，鯽血清中GSH 活力與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；而不同濃度甲醛處理組3h 血清中GSH活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.4 甲醛對鯽血清MDA 含量的影響

由圖4 可知，不同濃度甲醛浸泡6h 后，隨著脅迫時間的延長，鯽血清中MDA 含量大致呈現先降低后升高的變化趨勢，6h 達到最高值。1h 時50mg/L 甲醛處理組鯽血清中MDA 含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05），但是100mg/L 甲醛處理組MDA 含量顯著高于對照組（P＜0.05）。3h 時50mg/L 甲醛組MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05），而100mg/L 甲醛組與對照組無顯著性差異（P＞0.05），但是，50mg/L 和100mg/L 甲醛處理組在6h 均顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖4 甲醛處理對鯽血清MDA 含量的影響Fig.4 Effect of formaldehyde treatment on MDA content in serum of crucian carp

3 討論

甲醛能與蛋白質中氨基酸結合使蛋白質變性，起到殺滅各種生物的作用，已廣泛用于水產養殖疾病防治中[9]。有研究認為，當機體受到外源性化學物質刺激時，會導致體內產生過多的活性氧自由基（ROS），而ROS 能夠引起機體產生脂質過氧化損傷，進而發生細胞突變、DNA 損傷，嚴重時還會引起死亡。當機體發生損傷時，機體會產生一系列抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px和谷胱甘肽轉移酶（Glutathionetransferase，GST）等來防止過氧化損傷的發生[10,11]。體內酶性抗氧化系統和非酶性抗氧化系統構成機體的抗氧化防御系統[12]。酶性抗氧化酶能夠防止氧化代謝物對機體的損傷，這些酶除了可以相互保護，還能共同抵御外界脅迫因子產生的ROS 對機體的損傷[13]。當機體接觸到有害物質時，隨著接觸時間的延長或者毒性增強，其抗氧化系統遭到破壞，部分抗氧化物質含量和酶活性降低，機體無法清除體內過量的自由基，導致機體氧化損傷，最終表現為脂質過氧化產物MDA 含量增加[14]。本試驗用不同濃度甲醛藥浴鯽后，測定血清中SOD、CAT、GSH 活性和MDA 含量，旨在明確甲醛在治療疾病的同時對魚體抗氧化系統的影響作用。

魚類的非特異性免疫在應對逆環境應激中起主導作用，SOD、CAT 以及GPx 等抗氧化酶對清除機體氧化脅迫中產生的活性氧自由基起決定作用[15]，其中SOD 和CAT 的作用基本一致，共同清除體內過多的活性氧自由基，減少機體氧化損傷，是機體內重要的保護酶。SOD 是機體抗氧化防御系統的第一道防線，當體內活性氧增多時，SOD 首先發揮清除活性氧的功能，隨后CAT 發揮作用，降低活性氧含量，保護機體免受損傷。本試驗結果表明，血清中SOD和CAT 的變化趨勢基本一致，均為先升高后降低的趨勢。任海等[14]認為，上述變化趨勢可能與SOD 和CAT 行使的功能有關。本試驗中，上述兩種酶在3～6h 均顯著高于對照組（P＜0.05），其原因可能與體內過氧化損傷發生應激性增高有關。甲醛持續作用誘導鯽體內ROS 增加，機體反饋性增強抗氧化系統酶活力來對抗甲醛氧化損傷產生的過多ROS，這可能與毒物興奮作用有關[16]。強俊等[17]在研究氨氮與擁擠脅迫對吉富品系尼羅羅非魚Oreochromis niloticus幼魚肝臟抗氧化指標的影響中也發現，機體通過增加代謝來應對環境脅迫，氧自由基也隨之增加，SOD與CAT 活力的增加被認為是生物體對新陳代謝的適應，能夠減輕脂質過氧化物損傷。

GSH 作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物，是組織中主要的非蛋白質疏基化合物，可以使細胞含疏基的酶和蛋白質免受氧化損傷，在細胞抗ROS 損傷的解毒代謝中起著重要作用，在消除細胞中H2O2方面具有與CAT 相似的功能[18]。研究發現GSH 是機體抵御氧化損傷重要的酶，能夠調節生物體內自由基濃度的平衡，保持細胞結構的完整，是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。本試驗結果表明，隨著甲醛脅迫時間的延長，GSH 活性呈現先升高后下降的變化趨勢，不同濃度甲醛處理組均在3h 出現峰值，且低濃度甲醛組GSH 活性高于高濃度組，推測這種現象可能是由于低毒脅迫的誘導作用。王小嬌等[19]研究表明：尼羅羅非魚暴露在低濃度Cd 時，受Cd 脅迫而產生大量活性氧，應急系統被激活，GSH 含量隨Cd 質量濃度的增大而升高。

MDA 是一種高活性脂質過氧化產物，可以衡量脂質過氧化程度，間接反映動物機體細胞受自由基攻擊的的損傷程度，判定動物體的健康情況[20]。本試驗結果表明，鯽血清中MDA 含量隨著甲醛脅迫時間的延長而先降低后升高，3h 最低，6h 達最大值。其原因可能是甲醛脅迫使得組織中產生過多的活性氧，一方面機體通過提高自身的抗氧化酶活力如SOD、CAT 和GSH 等抗氧化酶來消除自由基，減弱脂質過氧化作用，最終表現為MDA 含量較低[21]；另一方面隨著甲醛濃度增加和脅迫時間延長，在一定程度上超過了機體所承受的范圍時，機體產生過量的活性氧對機體造成氧化損傷，破壞了細胞電子傳遞鏈、線粒體膜電位及ATP 能量產生，嚴重時引起機體細胞凋亡或壞死[22,23]。這也進一步提示，甲醛脅迫下MDA積累可能是甲醛對鯽產生毒害作用的主要原因之一。本研究中甲醛脅迫能否導致鯽細胞凋亡，需進一步實驗驗證。