飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長和免疫的影響

石和榮，何琪，呂晴霽，彭激夫，梁添發，陳奕彬，柳小春，楊宇晴，劉蘇，張海發，王慶，趙會宏

（1.廣東省海洋漁業試驗中心，廣東 惠州 516081；2.華南農業大學海洋學院，廣東 廣州 510640；3.廣東天地本草飼料科技有限公司，廣東 中山 528400）

虎龍雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）生長快、成活率高、肉質鮮美人工養殖得到了快速發展[1]。但隨著石斑魚養殖業集約化養殖規模的擴大，近海污染嚴重，養殖過程中疾病頻發，抗生素或化學藥物的濫用等對環境和人類健康產生了不良影響，嚴重制約了石斑魚養殖業的發展[2]。

中草藥是一種天然綠色飼料添加劑，包含生物堿、多糖、有機酸、揮發油等多種活性成分[3]。近年來，研究發現黃芪Astragalus membranaceus、板藍根Baphicacanthus cusia、金銀花Lonicera japonica 等多種中草藥能不同程度地提高水產動物的免疫力及生長性能[4,5]。如李華等[6]研究發現，投喂一定量的牛膝等中草藥可顯著提高大菱鲆Scophthalmus maximus 的免疫力。核苷酸被稱為條件營養物質，當動物體內源核苷酸合成不足時，需要來源于飼料的外源核苷酸加以補充，是一種新型綠色飼料添加劑[7]。目前，飼料中添加核苷酸對奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O.areus）[8]、大菱鲆[9]等養殖魚類生長及免疫的影響已有報道。大多數研究表明：飼料中添加核苷酸能進水產動物的生長發育，提高其免疫力?；堧s交斑是近年推廣的水產養殖石斑魚品種，關于中草藥或核苷酸對其作用效果報道較少。

本試驗通過研究在飼料中添加一種復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長及免疫功能的影響，以期為探索虎龍雜交斑循環水養殖中的病害防控技術，提高石斑魚循環水養殖的存活率和抗病力，以及探究水產動物的高效養殖提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

石斑魚基礎料（RUBY 牌）委托廣東越群飼料公司定制（表1）；復合中草藥添加劑由板藍根、黃岑、黃芪、忍冬藤、白芷、甘草共6 種中草藥按比例為1∶1∶1∶1∶1∶1 復配而成（由廣東天地本草飼料科技有限公司提供），經中藥粉末專用氣旋篩粉機加工，細度達到300 目。核苷酸（瑞士CHEMOFORMA 公司提供）由純化胞苷酸、純化腺苷酸、純化胸苷酸、純化鳥苷酸、純化鳥苷酸、純化核糖核酸按等質量比例（1∶1∶1∶1∶1∶1）復配而成。添加劑先與粘合劑混勻（粘合劑為a-淀粉，兩者比例為1∶0.2），然后在基礎飼料中分別加入2 g/kg、4 g/kg復合中草藥添加劑和4 g/kg 核苷酸添加劑，混合均勻，噴灑少量水霧，使其與飼料粘合，經小型制粒機制成粒徑為3 mm 的顆粒型膨化飼料，風干后置于-4℃的冰箱中冷藏，保存備用。

表1 基礎飼料組成和營養水平（風干基礎）Tab.1 Ingredient and utrition level of basal feed（on airdry basis）

1.2 試驗設計及試驗管理

試驗在廣東省海洋漁業試驗中心的室內循環水養殖系統中進行。試驗開始前，將平均質量（22.36±0.07）g 的試驗魚饑餓24h，挑選由中心提供的600 尾大小均勻、健康的雜交石斑魚放養于12個養殖桶中（有效養殖水體0.55 m3），每桶50 尾，隨機分為4 組，每組設置3 個重復。馴化一周后開始正式試驗。正式試驗時，每天早上8:30 和下午4:30各飽食投喂1 次，攝食5min 后，在養殖桶或網內設置投料籃，收集殘餌，記錄殘餌數量。每日記錄各試驗組投餌量、死亡率等，養殖周期為56 d。整個養殖過程中水溫為27.05～31.05℃，溶解氧為5.40～7.70mg/L，pH 為7.50～8.20，氨氮濃度小于0.3mg/L。

1.3 樣品采集與處理

采樣前停喂24h，將養殖桶內的試驗魚全部撈出，統計尾數和試驗魚總質量。從每個養殖桶中隨機選取20 尾魚測量體質量、體長等生長性能指標。然后，用1.0mL 的注射器抽取尾靜脈血液，注射于1.5mL 的離心管中，4 ℃下靜置4h 后，以5 000r/min離心10min，取上層清液分裝0.5mL 的離心管中，置于-80℃保存備用。用經過滅菌滅酶處理的采樣工具按順序解剖稱量內臟和肝臟質量，并將其前腸與肝胰臟、脾臟、腎臟三個免疫器官分別放入2mL 離心管中于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中備用。再將解剖后的魚去皮取背部肌肉，于-80℃保存備用。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能的計算

1.4.2 肌肉常規檢測

粗蛋白含量用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量用索氏抽提法測定。

1.4.3 血清生化指標

血清溶菌酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.4.4 mRNA 的相對表達量

采用熒光定量PCR 法測定虎龍雜交石斑魚肝胰臟、脾、腎中干擾素γ（IFN-γ）、熱休克蛋白70（HSP70）、白細胞介素β（IL-1β）相關基因的表達水平。用Magen 公司的Hipure Universal RNA Kits 試劑盒提取總RNA。用核酸濃度分析儀測定核酸溶液的A260/A280的比值即為核酸純度，其范圍在1.8～2.0之間，自動記錄各濃度。用瓊脂凝膠法檢測RNA 的質量。提取1μg 樣品RNA 后采用北京全式金生物技術有限公司的EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒（含去除基因組中殘留DNA 步驟）進行逆轉錄，合成cDNA。應用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，并在NCBI/Primer-BLAST 上進行比對，選擇特異性引物。所設計引物序列由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。PCR 引物序列見表2。以cDNA 為模板，采用熒光定量PCR 法，用北京全式金生物技術有限公司的TransScriptTip Green qPCR Super Mix 試劑盒測定肝胰腺、脾、腎、組織中白細胞介素-1β（IL-1β）、γ-干擾素（IFN-γ）和熱休克蛋白70（HSP70）免疫相關基因的相對表達水平。20 μL 的反應體系包括：10 μL 2×TransScriptTip Green qPCR Super Mix、0.4 μL Forward Primer（10 μM）、0.4 μL Reverse Primer（10 μM）、0.4 μL Passive Reference Dye（50х）、1 μL cDNA 和7.8 μL ddH2O。反應條件為：94℃30s、94℃5s、58℃15s、72℃10s，共40 個循環。每個樣品做3 次分析。采用的2-△△CT法計算各目的基因mRNA 的相對表達量。

表2 熒光定量PCR 引物序列Tab.2 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

所得數據用平均值±標準誤（Mean±SE）表示，用Excel 2018 軟件進行處理，通過SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）,并進行Duncan 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長性能的影響

由表3 可知：添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚的體質量增重率、特定生長率無顯著影響（P＞0.05），但顯著提高了虎龍雜交石斑魚的成活率（P＜0.05）；4g/kg 中草藥組飼料系數顯著低于2g/kg 中草藥組（P＜0.05）；4g/kg 中草藥組、4g/kg 核苷酸組肥滿度和臟體比顯著高于對照組（P＜0.05）；各組間虎龍雜交石斑魚肝體比無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚肌肉營養成分的影響

由表4 可知：添加復方中草藥或核苷酸的處理組肌肉蛋白和脂肪含量與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚血清溶菌酶的影響

由表5 可知：添加復方中草藥或核苷酸組魚血清溶菌酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），其中4 g/kg 核苷酸組最高。

2.4 添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚免疫相關基因表達的影響

飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚免疫相關基因表達的影響見圖1、圖2 和圖3。添加復方中草藥或核苷酸的飼料總體上提高了虎龍雜交石斑魚3 個器官細胞因子的mRNA 表達。2g/kg 中草藥組腎臟中HSP70、IL-1β 及脾臟中IFN-γ 表達量顯著高于對照組（P＜0.05），4g/kg 中草藥組肝中IL-1β 表達量顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.05）；腎臟和脾臟中IFN-γ 表達量顯著高于對照組（P＜0.05），4g/kg 核苷酸組脾中HSP70和IL-1β 表達量顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.05）；脾的IFN-γ 表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。

表3 飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚生長性能的影響Tab.3 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on growth performance of hybrid grouper

表4 飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚肌肉營養成分的影響Tab.4 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on muscular proximate composition of hybrid grouper

圖1 飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚HSP-70 表達的影響Fig.1 Effects of compound Chinese herbal medicine and nucleotides on the expression of HSP-70 in hybrid grouper

圖2 飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚IL-1β 表達的影響Fig.2 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IL-1β in hybrid grouper

圖3 飼料中添加復方中草藥或核苷酸對虎龍雜交石斑魚IFN-γ 表達的影響Fig.3 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IFN-γ in hybrid grouper

3 討論

3.1 添加復方中草藥對虎龍雜交石斑魚的影響

3.1.1 生長性能

本試驗中，在飼料中添加含有板藍根、黃芪、黃岑等的復方中草藥，虎龍雜交石斑魚的體質量增重率和特定生長率增加不明顯，但復方中藥的添加量為4g/kg 時，飼料系數降低了5.2%，存活率也顯著增加。這說明，飼料中添加適量的復方中草藥或核苷酸能在維持虎龍雜交石斑魚正常生長的同時，又大大增強了其抗病能力。徐安樂等[10]研究發現，在飼料中添加含有大黃、金銀花和黃芪等的復方中草藥，對珍珠龍膽石斑魚（E.lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀）的促生長效果不顯著，僅降低了餌料系數。而吳彬等[11]以含有0.5%黃芩、0.5%金銀花、0.5%板藍根、0.5%黃芪等氮等能飼料分別投喂吉富羅非魚Oreochromis niloticus 幼魚發現，各組魚體增重、特定生長率顯著提高，飼料系數顯著降低，其中黃芪組各項生長指標顯著高于其他實驗組。馬國紅等[12]探究了板藍根、黃芪、甘草等對鯉Cyprinus carpio 生長性能及其體成分的影響，認為適宜添加復方中草藥可以促進魚類生長，降低飼料系數。綜上所述，飼料中添加適量的中草藥能不同程度地促進水產動物生長，而給藥劑量不同，可能與添加中草藥種類和養殖對象的不同有關。中草藥中含有的多糖類、有機酸、生物堿、黃酮類能增加動物體內紅細胞數量，促進機體血紅蛋白、血清總蛋白的合成。中草藥可影響水產動物胃腸道內常在菌群的狀態，維護動物腸道健康，優化腸道對營養成分的吸收，促進水產動物的健康生長[3]。

3.1.2 免疫能力

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，主要來源于吞噬細胞，能破環細菌、真菌、病毒以及寄生物結構，顯著增強魚體的抗病能力。溶菌酶活性的高低直接顯示溶菌作用的強弱，可以代表機體免疫功能的狀況[13]。研究發現[14]，黃芪、黃岑中含有多糖、生物堿等營養成分，能有效促進相關免疫酶的合成。中草藥可提高水產動物血液中溶菌酶活性的研究報道屢見不鮮。李華等[6]以牛膝、板藍根、甘草等中草藥制成免疫增強劑投喂大菱鲆Scophthalmus maximus，顯著提高了其溶菌酶活性。李梅芳[15]等選用黃芪、黃岑等中草藥投喂大黃魚Pseudosciaena crocea，各組魚溶菌酶活性顯著上升，這與本研究結論相似。但在本試驗中，隨著復方中草藥含量的增加，溶菌酶活性有所減少，其原因可能與使用劑量有關，復方中草藥超過一定用量后是否會抑制血清溶菌酶的活性，有待下一步試驗探索。

相關研究表明：復方中草藥中的某些物質能誘導免疫相關基因的表達。IL-1β 作為IL 家族重要的一員，是最早表達的一個炎性細胞因子，它能誘導淋巴細胞的生長以及分泌一些細胞因子來增強免疫應答，殺滅病原，起到抗細菌、病毒、腫瘤的作用[16]。一定量的黃芪、板藍根、蒲公英等中藥多糖對IL-1β 的表達具有調節作用[17]。在哺乳動物中，IFN 可以分為α、β、γ 三種類型，三者均有抗病毒活性。其中，IFN-γ 為Ⅱ型對干擾素是一個單基因家族，在免疫調節以及炎癥反應中起重要作用。HSP70 是熱休克蛋白家族最重要和保守的蛋白，扮演著細胞因子和分子伴侶的雙層身份。很多研究報道，HSP70 具有多種生物學活性和功能，包括分子伴侶、免疫調節、抗氧化、提高機體耐受力、對細胞周期的調節等功能[18]。帥學宏等[19]研究發現，青蒿多糖提高了小鼠血清中IL-1β 和IFN-γ 質量濃度。王家敏[20]研究發現，黃芪、當歸等復方中草藥能誘導吉富羅非魚Hsp70 和IL-1β 基因在頭腎、肝臟、胸腺、鰓和脾臟組織中表達。本試驗結果證實了在飼料中添加復方中草藥誘導虎龍雜交石斑魚IL-1β、IFN-γ、HSP70 三種免疫相關基因在腎臟、脾臟組織中的合成與分泌。

3.2 添加核苷酸對虎龍雜交石斑魚的影響

3.2.1 生長性能

核苷酸是動物體內不可缺少的重要部分，它廣泛參與動物體內供能、脂肪代謝等生命過程，提供魚體快速生長時細胞復制所需的核苷酸，可增強代謝酶活性，促進動物生長、提高飼料利用率等[21]。本試驗結果表明，飼料中添加4 g/kg 的核苷酸，對虎龍雜交石斑魚的增重率、特定生長率、飼料系數無顯著性影響。與對照組相比，質量增重率、特定生長率分別增加7.24%和4.06%，且存活率顯著增加。韓春梅等[8]和Lin 等[22]研究發現，飼料中添加一定量的核苷酸能顯著促進奧尼羅非魚幼魚和點帶石斑魚Epinephelus malabaricus 的生長，但是各種試驗結果也不盡一致。Safar 等[23]發現，在飼料中添加核苷酸對細長爪鰲蝦Astacus leptodctylus 的促生長作用不明顯。在本試驗中，添加外源核苷酸沒有顯著促進虎龍雜交石斑魚的增重率和特定生長率，但較對照組略有增加。成活率的顯著性增加，說明一定量的核苷酸能有效增強虎龍雜交石斑魚的免疫力。據推測，核苷酸在水產動物中促生長效果可能存在種系的差異。有關外源核苷酸對石斑魚的生長性能研究報道較少，其作用機理尚不清楚，有待更深入的研究。

3.2.2 免疫能力

向梟等[24]研究發現，在飼料中添加519.85～774.00 mg/kg 核苷酸能提高鯉血清溶菌酶活性；曹俊明等[25]研究表明，飼料中添加0.8 g/kg 外源核苷酸可顯著提高凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 血清中溶菌酶活性，增強非特異性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。本研究表明，飼料中添加4 g/kg 核苷酸對虎龍雜交石斑魚血清溶菌酶活性雖無顯著影響，但與對照組相比增加了38.38%。這是否與試驗魚種、飼料組成、試驗條件、核苷酸的劑量及劑型不同有關，還需要進一步研究。本試驗發現，投喂核苷酸能誘導IL-1β、IFN-γ 和HSP70 三種免疫相關基因在虎龍雜交石斑魚腎臟、脾臟組織中的合成與分泌，這與Reda 等[26]的研究結果相一致。目前，關于外源核苷酸影響機體非特異性免疫功能的機理還不清楚，究其原因可能是參加免疫的大部分細胞合成的核苷酸不能滿足所需，影響了吞噬細胞和白細胞等的增殖、分化和活力以及紅細胞的數目。

3.3 結論

基礎飼料中添加復方中草藥或核苷酸可維持虎龍雜交石斑魚的正常生長，顯著提高其成活率（P＜0.05）；其中4g/kg 中草藥飼料系數顯著低于2g/kg 中草藥組（P＜0.05）；4g/kg 中草藥、4g/kg 核苷酸能顯著增加魚體肥滿度和臟體比（P＜0.05）；4g/kg 復方中草藥、2g/kg 中草藥或4g/kg 核苷酸能增強虎龍雜交石斑魚腎臟、脾臟中IL-1β、IFN-γ、HSP70 免疫相關基因的表達，其中，2g/kg 中草藥添加劑的增強效果更明顯。綜上所述，2g/kg、4g/kg 的復方中草藥添加量能有效促進虎龍雜交石斑魚生長，具有一定的增強免疫效果。