miR-155靶向SIRT1調(diào)控缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的活力、凋亡和氧化應(yīng)激

李世勛 周凡 王巖

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種小的非編碼RNA，長度約為20～25個核苷酸，它通過堿基互補配對方式與靶基因3'非翻譯區(qū)(UTR)部分或完全互補，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)〔1〕。近年研究證實miRNA在腫瘤形成、生長、轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤的標(biāo)志物〔2〕。miR-155具有調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎患者的炎癥反應(yīng)〔3〕、調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡〔4〕、調(diào)控胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔5〕、調(diào)控急性肺損傷炎性因子分泌〔6〕等功能。但miR-155在缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷中的研究尚未十分清楚。Sirtuins基因家族為Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶(SIRT)，該基因家族共有7個成員分別為SIRT1～SIRT7，其在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，且具有不同的酶活性和亞細(xì)胞定位〔7〕。SIRT1為Sirtuins基因家族中的成員之一。SIRT1在基因表達(dá)調(diào)控、染色體架構(gòu)維持、細(xì)胞周期進(jìn)程等方面均具有重要作用，參與細(xì)胞分化、凋亡和腫瘤進(jìn)展〔8〕。SIRT1具有抗氧化、抗自由基、抗衰老、調(diào)節(jié)代謝、調(diào)節(jié)免疫等多種功能,其對免疫的調(diào)節(jié)涉及固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程,對炎癥的抑制作用主要通過NF-κB通路實現(xiàn)，其之激活和抑制與多種疾病相關(guān),有望成為免疫相關(guān)性疾病治療的新靶點〔9〕。SIRT1可通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)人肝細(xì)胞的損傷〔10〕、調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ/SIRT1/NF-κBp65信號通路抑制促炎因子生成起保護潰瘍性結(jié)腸炎損傷作用〔11〕。李珊〔12〕在缺氧/復(fù)氧(H/R)心肌H9C2細(xì)胞的研究中證實，SIRT1可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號通路減輕H9C2細(xì)胞H/R損傷。目前SIRT1在缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷中的作用機制尚未完全清楚。本研究擬以H/R處理大鼠心肌H9C2細(xì)胞或大鼠原代心肌細(xì)胞為研究對象，觀察敲減miR-155、敲減SIRT1表達(dá)對細(xì)胞活力、凋亡和氧化應(yīng)激的影響，揭示miR-155可靶向SIRT1調(diào)控H/R大鼠心肌細(xì)胞的活力、凋亡和氧化應(yīng)激，將為心肌炎的治療奠定科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料 大鼠心肌H9C2細(xì)胞由本實驗室保存；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、超氧化物歧酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒、annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京萊寶公司；BCA蛋白定量試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于德國羅氏診斷有限公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)液和細(xì)胞裂解液(RIPA)均購于碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。半干轉(zhuǎn)膜儀購于美國BIO-RAD公司；流式細(xì)胞儀購于美國 FALS CALIBAR BD公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)購于美國ABI公司；紫外分光光度計購于美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Forma Scientific公司；PCR 儀購于美國BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分離培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2建立H/R H9C2細(xì)胞模型 將H9C2常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后換液培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，將H/R組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，用不含血清的低培養(yǎng)液置于85% N2、10% H2、5% CO2的37℃飽和濕度厭氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)6 h，然后加入新鮮含血清的DMEM培養(yǎng)基置于5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2 h。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將H9C2細(xì)胞隨機分成H/R+miR-155 inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors)、H/R+miR-NC inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-NC inhibitors)、H/R組(未轉(zhuǎn)染H/R H9C2細(xì)胞)和Control組(未轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞)、H/R+miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組(miR-155 inhibitors和SIRT1 blocker共轉(zhuǎn)染)、H/R+miR-155 inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors)、miR-155 inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors)、miR-NC inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-NC inhibitors)，以上各組細(xì)胞均按照LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行缺氧再復(fù)氧(缺氧6 h，復(fù)氧2 h)，之后進(jìn)行凋亡、Western印跡檢測、氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測。

1.2.4RT-qPCR實驗 RT-qPCR實驗(轉(zhuǎn)染后24 h檢測)不經(jīng)缺氧再復(fù)氧過程。Trizol法提取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞樣本總RNA，并用進(jìn)行RNA定量。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書操作，合成模板鏈cDNA。按照RT-qPCR試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行miR-124的測定。反應(yīng)結(jié)束后通過分析Ct值，以2-△△Ct法計算定量結(jié)果，測定miR-124的相對表達(dá)水平。按照每個樣品重復(fù)5次，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.2.5噻唑藍(lán)(MTT)實驗 將大鼠原代心肌細(xì)胞分離后用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用200目濾網(wǎng)除去未消化組織后，再用差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞，純化心肌細(xì)胞。將細(xì)胞隔天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第4代開始用于MTT實驗。

原代心肌細(xì)胞及將方法1.2.3各組細(xì)胞均分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時各加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后吸去上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩待結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。每組設(shè)5個重復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

將原代心肌細(xì)胞分為miR-155 inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors)、miR-NC inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-NC inhibitors)、H/R+miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組(共轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors和SIRT1 blocker)、H/R+miR-155 inhibitors組(共轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitors)，均用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行缺氧再復(fù)氧(缺氧6 h，復(fù)氧2 h)轉(zhuǎn)染成功后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48、72 h按上述方法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。

1.2.6Western印跡實驗 取適量對數(shù)生長期的各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，RIPA裂解后，提取總蛋白，BCA法蛋白定量后變性，然后按照操作步驟進(jìn)行蛋白電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。以目的條帶灰度值與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡 取適量對數(shù)生長期細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌 2次。用結(jié)合緩沖液 500 μl 懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的 annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞術(shù)分析測定。細(xì)胞的總凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.8酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 運用ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞氧化指標(biāo)LDH、SOD、 MDA、 NO的含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，分析結(jié)果。

1.2.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?取適量對數(shù)生長期的H9C2，取5 μl細(xì)胞裂解液與螢火蟲熒光素酶緩沖液和5 μl底物混勻，測熒光強度。然后加入海腎熒光素酶緩沖液和5 μl腔腸素底物，混勻，再次測得海腎熒光素酶活性。以psiCHECK2為載體，將SIRT1 WT、SIRT1 MUT用脂質(zhì)體法與載體共轉(zhuǎn)染，構(gòu)建psiCHECK2-SIRT1 WT和psiCHECK2-SIRT1 MUT質(zhì)粒載體，觀察miR-155與SIRT1的結(jié)合能力。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-155在H/R H9C2細(xì)胞中高表達(dá) 與Control組(1.00±0.12)比較，H/R 組的miR-155表達(dá)(3.85±0.16)顯著升高(P<0.05)，miR-155 在 H/R H9C2 細(xì)胞中高表達(dá)。

2.2敲減miR-155表達(dá)促進(jìn)H/R H9C2細(xì)胞的活力，抑制凋亡 將miR-155 inhibitors、miR-NC inhibitors轉(zhuǎn)染大鼠原代心肌細(xì)胞，用MTT法檢測細(xì)胞活力。與Control組相比，miR-NC inhibitors組miR-155表達(dá)差異不顯著(1.12±0.08，1.00±0.06)，細(xì)胞在12、24、48、72 h的增殖差異不顯著(P>0.05)；與miR-NC inhibitors組比較，miR-155 inhibitors組的miR-155表達(dá)顯著降低(0.36±0.01，P=0.000)，細(xì)胞在24、48 、72 h的增殖顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 MTT檢測各組細(xì)胞增殖

1)miR-NC inhibitors組與Control組相比，2)miR-155 inhibitors組與Control組相比

將miR-155 inhibitors、miR-NC inhibitors轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。H/R+miR-155 inhibitors組、H/R+miR-NC inhibitors組、H/R組和Control組的H/R H9C2細(xì)胞均用Western印跡檢測凋亡基因cleaved-caspase-3、Bcl-2的蛋白水平、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。H/R組較Control組，cleaved-caspase-3蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.001)，見表2，圖1A。H/R組較Control組細(xì)胞凋亡率顯著升高〔(18.84±2.45)% vs (8.36±1.21)%，P=0.000〕，見圖1B；H/R+miR-155 inhibitors組較H/R+miR-NC inhibitors組cleaved-caspase-3蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)，見表2，圖1A。H/R+miR-155 inhibitors組較H/R+miR-NC inhibitors組細(xì)胞凋亡率顯著降低〔(12.29±1.85)% vs (20.23±1.43)%，P=0.003〕，見圖1B。

表2 Western印跡檢測各組細(xì)胞中凋亡蛋白相對表達(dá)

1)H/R組與Control組相比，2)H/R+miR-NC inhibitors組與H/R+miR-155 inhibitors組相比，表3同

A：敲減miR-155的H/R H9C2細(xì)胞的蛋白表達(dá)圖；B：敲減miR-155的H/R H9C2細(xì)胞凋亡圖圖1 敲減miR-155的H/R H9C2細(xì)胞蛋白表達(dá)和凋亡圖

2.3敲減miR-155表達(dá)對H/R H9C2細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 運用ELISA檢測H/R+miR-155 inhibitors組、H/R+miR-NC inhibitors組、H/R組和Control組H/R H9C2細(xì)胞中LDH、SOD、 MDA、NO的含量。與H/R+miR-NC inhibitors組比較，H/R+miR-155 inhibitors組的LDH、MDA、NO含量顯著降低，SOD含量顯著升高(P<0.05，P<0.001)；與Control組比較，H/R組的LDH、MDA、NO含量顯著升高，SOD含量顯著降低(P<0.01，P<0.001)。見表3。

表3 miR-155對H/R H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.4miR-155靶向調(diào)控SIRT1 運用Targetscan預(yù)測到miR-155與SIRT1存在靶向結(jié)合位點(圖2A)。運用雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-155 mimics組和miR-155 inhibitors組轉(zhuǎn)染熒光素酶載體psiCHECK2-SIRT1-WT、psiCHECK2-SIRT1-MUT的H9C2細(xì)胞的熒光素酶活性，miR-155 mimics組較miR-NC mimics組SIRT1 3'UTR-WT細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低；miR-155 inhibitors組較miR-NC inhibitors組SIRT1 3'UTR-WT細(xì)胞熒光素酶活性顯著升高，見圖2B、C，表4。miR-155 mimics組較miR-NC mimics組SIRT1的蛋白表達(dá)顯著降低(0.56±0.04，1.00±0.08)，miR-155 inhibitors組較miR-NC inhibitors組SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高(2.23±0.09，1.00±0.06)。可見，miR-155靶向調(diào)控SIRT1。

表4 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-155與SIRT1靶向結(jié)合

2.5敲減SIRT1表達(dá)對大鼠原代心肌細(xì)胞活力及H/R H9C2細(xì)胞凋亡的影響 與Control組相比，miR-155 inhibitors組細(xì)胞在48 、72 h時，細(xì)胞的增殖顯著升高，與miR-155 inhibitors組相比，miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組細(xì)胞在48 、72 h時，細(xì)胞的增殖顯著升高(P<0.05，P<0.01)，見表5。與Control組相比，H/R組細(xì)胞中SIRT1、Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著降低，cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)，見表6、圖3A、B，細(xì)胞凋亡率顯著升高〔(22.84±1.35)%，(7.21±0.40)%，P<0.05〕，見圖3C；與miR-155 inhibitors組相比，miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組細(xì)胞中SIRT1、Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著降低，cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)，見表6、圖3A、B，細(xì)胞凋亡率顯著升高(18.54±1.38，12.63±1.03)，見圖3C。

表5 miR-155通過SIRT1調(diào)控H9C2細(xì)胞增殖

1)miR-155 inhibitors組與Control組相比， 2)miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組與miR-155 inhibitors組相比

表6 miR-155通過SIRT1調(diào)控H9C2細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)

1)H/R組與Control組相比，2)H/R+miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組與H/R+miR-155 inhibitors組相比，表7同

圖3 敲減SIRT1表達(dá)對心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)和凋亡的影響

2.6敲減SIRT1對H/R H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 H/R組較Control組LDH、MDA、NO含量顯著升高，SOD含量顯著降低(P<0.001)；H/R+miR-155 inhibitors+SIRT1 blocker組較H/R+miR-155 inhibitors組LDH、MDA、NO含量顯著升高，SOD含量顯著降低。見表7。可見miR-155靶向SIRT1調(diào)控H/R H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

表7 miR-155通過SIRT1調(diào)控H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激

3 討 論

心血管疾病為世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原因，其中以心肌缺血再灌注損傷最為常見，危險性最大。目前臨床上常用動脈搭橋、溶栓治療、皮冠狀動脈介入術(shù)治療早期心肌缺血損傷。心肌缺血再灌注是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞自噬、鈣超載等，此為缺血性心臟病患者預(yù)后不良的重要原因〔13〕。活性氧簇和血管活性物質(zhì)NO在其中起重要作用〔14〕。因此，對心臟病的相關(guān)發(fā)病機制研究具有重要意義。

miRNA為一類內(nèi)源性的小核苷酸片段，約有30%的人類基因受miRNA的調(diào)節(jié)〔15〕。miRNA在很多心臟病的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，如心肌肥大、心肌凋亡及血管生成等病理生理過程〔16〕。近幾年miRNA靶向治療各種心臟病的研究日益增多。柳培雨〔17〕在心肌缺血再灌注損傷中的研究中，闡明miRNA-214在心肌損傷中表達(dá)上調(diào)且具有保護心肌損傷功能。賀王偉〔18〕在心肌梗死的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-155對小鼠急性心肌梗死的心肌重構(gòu)具有促進(jìn)作用，其作用機制可通過靶向調(diào)控腫瘤p53蛋白誘導(dǎo)核蛋白1影響心臟成纖維細(xì)胞蛋白合成、凋亡、增殖及表型轉(zhuǎn)化實現(xiàn)。

本研究運用RT-qPCR檢測H/R H9C2細(xì)胞中miR-155的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-155高表達(dá)，這與賀王偉等的研究結(jié)果相吻合；用MTT法、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)及ELISA檢測敲減miR-155表達(dá)的H/R H9C2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，敲減miR-155 可促進(jìn)H/R H9C2細(xì)胞的活力、抑制凋亡、促進(jìn)氧化應(yīng)激；運用Targetscan預(yù)測miR-155與SIRT1存在結(jié)合靶點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSIRT1為miR-155的靶點，且與miR-155表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-155參與心肌細(xì)胞生長、凋亡和氧化應(yīng)激。

SIRT1存在于細(xì)胞核內(nèi)，通過穿梭調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中的靶基因，其具有抗炎、抗氧化。抗凋亡等作用〔19〕。SIRT1由747個氨基酸組成，形成一個高度保守的催化核心結(jié)構(gòu)域 ，且具有高度無序的N-末端和C-末端區(qū)域，該核心結(jié)構(gòu)域為發(fā)生NAD+依賴性脫乙酰化反應(yīng)的區(qū)域〔20〕。已有研究報道，松果體素可上調(diào)SIRT1表達(dá)〔21〕、miR-34a可下調(diào)SIRT1表達(dá)〔22〕、TNF-α可抑制SIRT1活性〔23〕。孫秀玉等〔13〕在研究Sirtuin家族對心肌缺血再灌注損傷的研究中闡明，SIRT1可通過多靶點抵抗細(xì)胞氧化應(yīng)激，且SIRT1的抗氧化作用在心肌保護中具有重要作用。Qiu等〔24〕發(fā)現(xiàn)，SIRT1為miR-204的直接靶點，且過表達(dá)SIRT1可以部分逆轉(zhuǎn)miR-204對H/R誘導(dǎo)的H9C2凋亡和自噬的影響。本研究通過檢測敲減SIRT1表達(dá)的H/R H9C2細(xì)胞的活力、凋亡蛋白cleaved-caspase-3和Bcl-2的表達(dá)、細(xì)胞凋亡率和氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、SOD、MDA、NO含量發(fā)現(xiàn)，敲減SIRT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)敲減miR-155表達(dá)對H/R H9C2細(xì)胞的促生長、抑凋亡及促氧化應(yīng)激作用，揭示SIRT1具有減輕H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的作用。

綜上所述，miR-155可促進(jìn)大鼠原代心肌細(xì)胞生長、抑制H/R心肌H9C2細(xì)胞凋亡和促進(jìn)氧化應(yīng)激，該機制可能與靶向SIRT1有關(guān)，為心臟病的治療提供新靶點。