FAP-α與VEGF 在乳腺癌中的表達及臨床意義

段佳佳，王瑩

1應急總醫院普外腫瘤科，北京 100028

2首都醫科大學附屬北京朝陽醫院病理科，北京 100020

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，據統計，2005—2014年，乳腺癌的發病率居全球女性腫瘤第1位，病死率居全球女性腫瘤第2位[1]。不同于其他實體腫瘤，乳腺癌具有異質性，因而其治療方向逐漸從腫瘤細胞轉移至腫瘤微環境。癌相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）是腫瘤微環境的重要組成部分，而成纖維細胞激活蛋白-α（fibroblast activation protein-α，FAP-α）是特異性表達于CAF表面的抗原分子，FAP-α具有促進微血管生成的特性，可以參與腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移過程。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種促進血管內皮細胞生長的因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性和血管生成等作用。目前，關于FAP-α、VEGF與乳腺癌細胞生物學特性的關系尚未見報道。因此，本研究對乳腺癌患者乳腺癌組織中FAP-α、VEGF的表達情況及相關性進行分析，并探討了其與乳腺癌患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年7月至2012年7月首都醫科大學附屬北京朝陽醫院收治的乳腺癌患者。所有患者均經病理證實為乳腺癌，且均有詳細的臨床資料、手術記錄，術前均未接受放療、化療等抗腫瘤治療。本研究共納入乳腺癌患者74例，患者的年齡為31～79歲，平均年齡為（51.8±11.5）歲；國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer，UICC）乳腺癌TNM分期[2]：Ⅰ期32例，ⅡA期28例，ⅡB期4例，ⅢA期10例；導管原位癌8例，浸潤性導管癌60例（1級4例，2級36例，3級20例），黏液癌2例，小葉癌2例，其他2例；腫瘤直徑為1.5～6.5 cm，中位腫瘤直徑為2 cm；T1c期42例，T2期30例，T3期2例；有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移56例；遠處轉移：1例患者于術后3年發生肺轉移，1例患者于術后3年發生腦轉移，1例患者于術后4年發生腦轉移，1例患者于術后4年發生骨轉移。收集74例乳腺癌患者的乳腺癌組織標本；同時，收集同期于首都醫科大學附屬北京朝陽醫院行手術切除的20例乳腺纖維腺瘤和乳腺增生患者的乳腺組織為正常對照，其中乳腺纖維腺瘤組織10例，乳腺增生組織10例。

1.2 免疫組化染色法檢測不同組織中FAP-α、VEGF 蛋白的表達

收集乳腺癌組織標本和正常乳腺組織標本，經10%中性緩沖福爾馬林固定液固定乳腺組織，常規進行乳腺組織取材、脫水、石蠟包埋制作石蠟包埋組織塊，切成4 μm石蠟切片，常規載玻片撈片。兔抗人FAP-α多克隆抗體（1∶50，購自美國Vitatex公司）、兔抗人VEGF多克隆抗體（1∶100，購自武漢博士德生物工程有限公司）均應用生物素標記的二抗及二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色系統（購自北京中杉金橋生物技術有限公司），行鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法染色，石蠟切片均需常規脫蠟，再經梯度乙醇脫水，而后3%H2O2室溫滅活30 min，采用微波抗原修復，采用正常山羊血清封閉30 min，加入一抗4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色、脫水、透明、封片。將已知的陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組化染色結果判定標準

免疫組化染色切片由2名高年資主治醫師采用雙盲方法判讀。FAP-α主要表達于乳腺癌間質中成纖維細胞的細胞質及腫瘤細胞中，呈淡黃色或棕黃色顆粒。VEGF主要表達于細胞質中，呈棕黃色顆粒。參照Henry等[3]的評分系統對FAP-α和VEGF的表達情況進行半定量評價：陰性，免疫組化染色陰性或＜1%的腫瘤細胞陽性；弱陽性，1%～10%的腫瘤細胞陽性；中度陽性，11%～50%的腫瘤細胞陽性；強陽性，＞50%的腫瘤細胞陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示；計數資料以例數表示；相關性分析采用Spearman非參數相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAP-α蛋白在乳腺癌組織中的表達情況

FAP-α蛋白表達于乳腺癌細胞和間質細胞的細胞質中（圖1），但在正常乳腺組織的導管上皮細胞和間質細胞的細胞質中不表達。免疫組化染色結果顯示，74例乳腺癌患者中，FAP-α蛋白陰性表達6例，弱陽性表達26例，中度陽性表達28例，強陽性表達14例。

圖1 乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 VEGF 蛋白在乳腺癌組織中的表達情況

VEGF蛋白表達于乳腺癌細胞的細胞質中（圖2），但在正常乳腺組織的導管上皮細胞中不表達。免疫組化染色結果顯示，74例乳腺癌患者中，VEGF陰性表達8例，弱陽性表達34例，中度陽性表達20例，強陽性表達12例。

圖2 乳腺癌組織中VEGF 蛋白的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.3 乳腺癌組織中FAP-α、VEGF 蛋白表達的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，乳腺癌患者乳腺癌組織中VEGF與FAP-α的表達水平呈正相關（r=0.321，P＜0.05）。

2.4 乳腺癌組織中FAP-α、VEGF 蛋白表達與乳腺癌患者臨床特征的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，乳腺癌組織中VEGF蛋白的表達水平與乳腺癌患者的T分期、N分期、臨床分期均呈正相關（P＜0.05）；乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達水平與乳腺癌患者的N分期、臨床分期均呈正相關（P＜0.05）。（表1）

表1 乳腺癌組織中FAP-α、VEGF蛋白表達與乳腺癌患者臨床特征的相關性（n=74）

3 討論

乳腺癌是女性高發腫瘤之一，且病死率居高不下。相關研究表明，早期乳腺癌患者診斷時，已有約30%的患者發生復發或轉移，而6%～10%的乳腺癌患者在確診時已發生遠處轉移[4]。DeSantis等[5]研究顯示，超過90%的乳腺癌患者的死亡不是由原發腫瘤本身導致的，而是由腫瘤細胞遠處轉移導致。腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移均離不開腫瘤微環境，因此，針對乳腺癌微環境致癌機制的研究對乳腺癌的早期診斷和治療具有重要意義。

FAP-α是由Rettig等[6]于1986年首先報道的應用單克隆抗體F19識別的一種膜抗原，屬于Ⅱ型絲氨酸蛋白酶類，基因定位于2q23[7]，分子量約為73 kD，具有分解明膠和Ⅰ型膠原的活性以及類似二肽基肽酶的活性；其可以降解細胞外基質，參與生物活性肽和趨化因子的裂解，從而使腫瘤細胞脫離原來的位置，導致腫瘤細胞的侵襲、轉移[6]。已有研究顯示，FAP-α具有膠原酶活性，可以促進腫瘤細胞的侵襲[8-11]。當實體腫瘤（包括上皮來源的惡性腫瘤）的直徑大于1～2 mm時，需要通過微環境的基質形成獲取腫瘤細胞存活和生長所必須的營養物質；而活化的成纖維細胞是這種起支持營養作用的基質成分所必需的。FAP-α是增生性成纖維細胞的表面標志物，可能參與調控成纖維細胞的生長、胚胎發育、組織修復及惡性腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移過程，是腫瘤微環境中重要的活性產物之一。

本研究結果顯示，FAP-α表達于乳腺癌細胞和間質細胞的細胞質中，但在正常乳腺組織的導管上皮細胞和間質細胞的細胞質中不表達。Park等[12]和Shi等[13]研究均顯示，FAP-α無論在腫瘤細胞還是在間質細胞中均可以表達。Liu等[14]研究顯示，FAP-α在腫瘤細胞中的表達水平高于間質細胞。由于FAP-α可以同時表達于乳腺癌細胞和間質細胞的細胞質中，因而針對FAP-α的靶向治療也可以同時作用于腫瘤基質的間質細胞和腫瘤細胞，該方法既可以抑制腫瘤細胞賴以生存的間質，又可以直接殺傷腫瘤細胞。本研究進一步分析顯示：乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達水平與乳腺癌患者的N分期呈正相關（P＜0.05）。Liu等[14]研究顯示，FAP-α表達水平與腫瘤患者的預后及淋巴結轉移呈正相關。Koperek等[15]研究結果顯示，在甲狀腺髓樣癌中，FAP-α的表達水平與淋巴結轉移呈正相關，提示其可能是甲狀腺髓樣癌患者預后的相關因子，該研究結果與本文研究結果相似。還有研究表明，FAP-α高表達與胰腺癌患者預后差有關[13,16]，且FAP-αmRNA是非小細胞肺癌患者預后的獨立影響因素[17]。另外，研究還發現，FAP-α在女性乳腺癌的發生、發展中具有重要作用，可以作為乳腺癌預后的重要預測因子[18]。本研究結果顯示，乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達水平與乳腺癌患者的臨床分期呈正相關（P＜0.05），提示臨床可以通過檢測FAP-α的表達情況，對部分高風險、預后差的乳腺癌患者進行篩選，進而盡早采取有效的預防及治療措施。

相關研究表明，FAP-α可能參與了腫瘤微血管的生成[19-20]。Cao 等[20]研究結果顯示，FAP-α可以激活細胞外基質中的VEGF。Patsouras等[21]應用共聚焦激光掃描顯微鏡和常規免疫組化法對胰腺癌中FAP-α和VEGF的表達情況進行分析，結果顯示FAP-α較VEGF可以更好地預測胰腺癌患者的預后情況。Li等[22]通過免疫組化法檢測了110例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者中VEGF的表達情況，結果顯示VEGF表達水平與乳腺癌患者的腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結轉移均呈正相關，提示VEGF與乳腺癌患者的疾病進展和不良預后有關。Goussia等[23]研究發現，VEGF高表達提示乳腺癌患者預后不良。本研究結果還顯示，乳腺癌患者乳腺癌組織中VEGF與FAP-α的表達水平呈正相關（P＜0.05），乳腺癌組織中VEGF蛋白的表達水平與T分期、N分期及臨床分期均呈正相關（P＜0.05）。提示VEGF的表達水平越高，腫瘤微環境中血管生成活性越高，新血管生成越多，越有利于腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移。

綜上所述，乳腺癌組織中FAP-α蛋白與VEGF蛋白的表達呈正相關，且這兩種蛋白與乳腺癌患者的N分期及臨床分期均呈正相關，可能參與了乳腺癌的發生發展過程。深入探究FAP-α、VEGF在乳腺癌發生發展過程中的作用機制，可為臨床調控機體的抗腫瘤免疫應答及建立有效的治療策略提供新思路。