宮頸鱗狀細胞癌中SIX1、SIX2、MMP11的表達及臨床意義

賀敏，陳勇偉

十堰市太和醫院1婦科，2泌尿外科，湖北 十堰 442000

宮頸鱗狀細胞癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展具有相對鮮明的階段性特征，即從低級別宮頸上皮內瘤變發展至高級別宮頸上皮內瘤變，甚至癌變發展為浸潤癌[1]。腫瘤細胞具有明顯的增殖和轉移能力[2]?；|金屬蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）是基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族中的重要成員，對細胞外基質成分的降解作用較強，并能夠促進腫瘤細胞的遷移[3]。同源異型蛋白SIX1和同源異型蛋白SIX2屬于轉錄調控因子，可以調控下游多種基因的表達，尤其是與腫瘤細胞增殖和遷移有關的基因。本研究探討了宮頸鱗狀細胞癌中SIX1、SIX2和MMP11表達情況的相關性及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年9月至2014年8月十堰市太和醫院收治的行宮頸鱗狀細胞癌根治術的宮頸鱗狀細胞癌患者。納入標準：①行全子宮、雙附件及區域淋巴結清掃術，術后均輔以放療、化療（2～4個療程），治療方法無明顯差別；②均經病理學檢查確診；③符合世界衛生組織（WHO）關于宮頸鱗狀細胞癌的診斷標準[4]；④臨床資料完整；⑤術后石蠟標本均于病理科保存完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②病理形態中合并腺癌、肉瘤成分；③術前接受過放療、化療等抗腫瘤治療。根據納入、排除標準，本研究共納入125例宮頸鱗狀細胞癌患者，患者年齡為35～78歲，平均年齡為（54.2±9.4）歲。另選取39例宮頸高級別上皮內瘤變患者，年齡為32～68歲，平均年齡為（50.1±10.2）歲；選取39例宮頸低級別上皮內瘤變患者，年齡為30～59歲，平均年齡為（42.1±10.7）歲；選取39例慢性宮頸炎患者，年齡為30～65歲，平均年齡為（40.3±9.8）歲。全部患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。收集經病理確診的宮頸病變患者的術后石蠟包埋組織標本。

1.2 檢測方法

全部患者的術后組織標本均應用中性福爾馬林緩沖液固定，切取厚度為2 mm的組織置于包埋盒內，常規脫水，石蠟包埋，切片后置于膠片上。SIX1、SIX2和MMP11均為濃縮液，先行預實驗，選擇最佳顯色的濃度用于正式實驗（最佳顯色濃度：SIX1 為1∶100，SIX2 為1∶200，MMP11 為1∶300）。正式實驗均采用免疫組化二步法進行檢測，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，實驗操作嚴格做好質量控制工作，減少人為誤差。

1.3 結果判定

對SIX1、SIX2和MMP11染色結果的判斷標準由病理科醫師參照相關文獻[5-6]進行適當修改。SIX1、SIX2和MMP11定位于細胞質和部分細胞膜，陽性細胞為淺黃色、黃色和棕黃色。根據染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分。染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞所占百分比：在400倍視野下計算染色細胞占視野細胞總數的百分比，共計數5個視野，取平均值，其中，＜5%為0分，5%～10%為1分，11%～30%為2分，31%～50%為3分，＞50%為4分。兩項得分相加為最終評分，最終評分≤2分為陰性，＞2分為陽性。計算不同組織中SIX1、SIX2和MMP11的陽性表達率。

1.4 統計學方法

采用SAS 6.12軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson法進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同宮頸病變患者宮頸病變組織中SIX1、SIX2和MMP11陽性表達情況的比較

宮頸鱗狀細胞癌組織、宮頸高級別上皮內瘤變組織、宮頸低級別上皮內瘤變組織、慢性宮頸炎組織中SIX1、SIX2和MMP1的陽性表達率比較，差異均有 統 計 學 意 義（χ2=31.418、41.150、21.826，P＜0.01）。宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP1的陽性表達率均明顯高于宮頸高級別上皮內瘤變組織、宮頸低級別上皮內瘤變組織和慢性宮頸炎組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同宮頸病變組織中SIX1、SIX2和MMP11陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11陽性表達情況的比較

腫瘤最大徑≥2 cm、有淋巴結轉移、增殖指數≥25%的宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1的陽性表達率均高于腫瘤最大徑＜2 cm、無淋巴結轉移、增殖指數＜25%的宮頸鱗狀細胞癌患者，差異均有統計學意義（χ2=17.487、20.028、6.074，P＜0.05）；不同脈管瘤栓情況宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。腫瘤最大徑≥2 cm、有淋巴結轉移、增殖指數≥25%的宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX2的陽性表達率均明顯高于腫瘤最大徑＜2 cm、無淋巴結轉移、增殖指數＜25%的宮頸鱗狀細胞癌患者，差異均有統計學意義（χ2=8.893、15.012、12.561，P＜0.01）；不同脈管瘤栓情況宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX2的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。腫瘤最大徑≥2 cm、有淋巴結轉移、有脈管瘤栓的宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中MMP11的陽性表達率均明顯高于腫瘤最大徑＜2 cm、無淋巴結轉移、無脈管瘤栓的宮頸鱗狀細胞癌患者，差異均有統計學意義（χ2=14.468、32.200、15.873，P＜0.01）；不同增殖指數宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中MMP11的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11的陽性表達情況（n=125）

2.3 宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11表達的相關性

Pearson相關性分析結果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1與MMP11的表達呈正相關（r=0.55，P=0.029），SIX2與 MMP11的表達呈正相關（r=0.49，P=0.042），SIX1與SIX2的表達未見明顯相關性（P＞0.05）。

3 討論

宮頸鱗狀細胞癌發生于宮頸表面的鱗狀上皮，其發生、發展與人乳頭瘤病毒感染有關，人乳頭瘤病毒感染會導致細胞發生癌變，從而形成挖空細胞。病情進展時，宮頸鱗狀上皮發生異型增生。多種腫瘤相關基因在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達異常。對于浸潤性宮頸鱗狀細胞癌，常表現出非角化性鱗狀細胞癌的特征。宮頸鱗狀細胞癌患者的預后較差，生存時間較短，但是，不同宮頸鱗狀細胞癌患者的生存時間并不完全一致。臨床評估宮頸鱗狀細胞癌患者預后的輔助指標包括淋巴結轉移、TNM分期、周圍組織的侵犯情況等，這些指標不能從根本上判斷患者的預后，而分子生物學的發展為宮頸鱗狀細胞癌患者預后的判斷提供了可能。有研究顯示，在腫瘤進展的過程中，腫瘤細胞可分泌MMP，目前發現MMP家族共包括28個成員，在大部分惡性腫瘤中均有表達，其功能各不相同[7]。MMP11是MMP家族的重要成員，可以有效分解纖溶酶原及膠原，從而促進腫瘤的遷移[8]。也有研究認為MMP11能有效調節腫瘤間質的微血管新生[9]。MMP11在腫瘤病變過程中能降解非細胞外基質的絲氨酸蛋白酶抑制劑和胰島素樣生長因子結合蛋白-1，在細胞內以45 kDa的活化酶形式進行釋放，在細胞外被激活，調控下游蛋白的表達。細胞間的黏附作用常與MMP11關系密切，其可以使腫瘤細胞間的連接松動，使細胞脫離原發灶，進而形成轉移灶[10]。SIX1和SIX2屬于腫瘤促進因子，可以作為轉錄因子參與多種組織的形成和發育。有研究發現，SIX1在正常成熟組織中的表達水平較低，而在惡變組織中的表達水平明顯升高；另外，SIX1轉錄時能夠調控多種促癌基因的表達和腫瘤細胞的增殖[11-12]。有研究認為，SIX1能夠調節轉化生長因子信號通路的過表達，激活血管內皮生長因子，有效調控腫瘤間質的脈管生成；SIX1能夠抑制上皮細胞的黏附作用和細胞間的結合程度，促進腫瘤的增殖、浸潤和轉移[13]。SIX2還具有調控上皮-間充質轉化的作用，能夠使腫瘤浸潤的前沿枝芽狀的細胞表達波形蛋白（vimentin）等標志物，進而增強腫瘤細胞和間質細胞的同源性。SIX1對腫瘤的調控作用還表現在對MMP的調節方面，其能夠抑制間質的轉移屏障作用，使腫瘤細胞發生轉移[14]。SIX2還能夠通過調控B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白等的表達從而發揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用。因此，與SIX1相比，SIX2的作用可能更加廣泛，其調控腫瘤進展的作用通路更多[15]。

本研究結果顯示，不同宮頸病變組織中SIX1、SIX2和MMP11的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），提示SIX1、SIX2和MMP11參與宮頸病變的發生與發展。本研究結果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11的表達情況可能與腫瘤最大徑和淋巴結轉移的關系最大，提示SIX1、SIX2和MMP11可以促進宮頸鱗狀細胞癌的生長和轉移。腫瘤細胞呈樹根狀向周圍組織生長，對局部組織和周圍鄰近器官具有明顯的破壞作用。本研究結果顯示，宮頸病變組織中SIX1和SIX2的陽性表達率可能與增殖指數有關，MMP11的陽性表達率可能與脈管瘤栓情況有關，提示SIX1和SIX2能夠促進宮頸鱗狀細胞癌細胞的增殖，MMP11能夠促進宮頸鱗狀細胞癌組織的脈管侵犯。Pearson相關性分析結果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1和MMP11、SIX2和MMP11的表達均呈正相關（r=0.55、0.49，P＜0.05），提示SIX1、SIX2可能通過調節MMP11的表達從而發揮促進宮頸鱗狀細胞癌細胞轉移的作用。由于以上因素均與腫瘤的生物學行為相關，因此，三者的異常表達預示著宮頸鱗狀細胞癌不良生物學行為的發生。這為臨床提供了輔助判斷宮頸鱗狀細胞癌生物學行為的指標，也為宮頸鱗狀細胞癌患者個體化治療的實施提供了支持。有研究發現，SIX家族通過對MMP11進行調控，調節腫瘤的生長和侵襲過程[16-17]。本研究發現SIX1和SIX2的表達與脈管癌栓無明顯相關性，提示二者對脈管的浸潤作用不明顯，但是其具體機制尚需要更多的實驗加以證實[18-19]。應用其他實驗手段檢測SIX1和SIX2的表達也是驗證其與宮頸鱗狀細胞癌細胞發生轉移關系的重要手段。

綜上所述，SIX1、SIX2和MMP11在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率高，SIX1、SIX2的陽性表達率可能與宮頸鱗狀細胞癌的腫瘤最大徑、淋巴結轉移情況、增殖指數有關，MMP11的陽性表達率可能與宮頸鱗狀細胞癌的腫瘤最大徑、淋巴結轉移情況、脈管瘤栓情況有關。SIX1、SIX2和MMP11對宮頸鱗狀細胞癌的發生、發展具有一定的調節作用。SIX1和SIX2可能通過調控MMP11對宮頸鱗狀細胞癌的發生、發展起到一定的調節作用。SIX1、SIX2和MMP11的表達可能在宮頸鱗狀細胞癌患者預后的判斷中具有一定的參考價值。本研究主要側重于對SIX1、SIX2和MMP11蛋白的表達情況進行研究，其mRNA的改變可能與蛋白的表達具有協同作用，后續研究應針對SIX1mRNA、SIX2mRNA和MMP11mRNA的表達進行實驗設計，對闡明SIX1、SIX2與MMP11的關聯性及其作用機制將具有更大的意義。