LBC聯合BRAFV600E 基因檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的應用價值△

趙清泉，程思賢，許建華，鄭正榮

福建醫科大學附屬第二醫院甲乳外科，福建泉州 362000

甲狀腺結節是臨床中常見疾病，全球發病率約4%～7%，其中4%～8%的甲狀腺結節為甲狀腺癌，甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤[1]，也是近年來中國發病率增長最快的惡性腫瘤之一，其病理類型中的60%為甲狀腺乳頭狀癌[2]。超聲引導下對甲狀腺結節行細針穿刺細胞學檢查（fine needle aspiration cytology，FNAC）是臨床診斷甲狀腺癌的首選方案，通常采用傳統涂片（coventional smear，CS）診斷甲狀腺結節[1]。但CS的涂片質量較差，10%～40%的甲狀腺結節無法明確診斷及判別[3]。當FNAC中選用液基細胞學（liquid-based cytology，LBC）技術制片，涂片質量更優，目前在臨床上也較為廣泛地使用。B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）最常見的突變是第600位密碼子突變（V600E），BRAFV600E基因突變也是甲狀腺癌常見的基因突變類型，在甲狀腺乳頭狀癌中占29%～84%，且與甲狀腺癌的侵襲程度密切相關[3]。有研究顯示，BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺癌實體瘤臨床診斷、良惡性鑒別診斷、預后評估方面有重要指導作用[4]。然而，目前臨床關于LBC聯合BRAFV600E基因突變鑒別診斷甲狀腺結節良惡性的報道較少。因此，本研究采用LBC及BRAFV600E對甲狀腺乳頭狀癌及良性病變進行鑒別診斷，旨在提高臨床診斷甲狀腺乳頭狀癌的準確性，為臨床診治提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年12月至2017年11月福建醫科大學附屬第二醫院已進行手術治療的90例甲狀腺結節患者。納入標準：術前均行CS、LBC和BRAFV600E檢測，并且已經手術切除甲狀腺結節的患者。排除標準：術后病理結果顯示為非乳頭狀癌的甲狀腺惡性腫瘤患者。90例甲狀腺結節患者中，男性11例，女性79例，年齡13～67歲，平均（44.72±9.69）歲；腫物直徑 5.0～75.0 mm，平均（29.4±10.7）mm；病程1天～20年；28例為單發結節，62例為多發結節；超聲TI-RADS 4A～5類為58例，超聲TI-RADS 2～3類為32例。

1.2 檢測方法

所有患者術前均先行CS和LBC檢測，并同時行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRTPCR）法進行BRAFV600E基因檢測。

患者取仰臥位，肩部墊軟枕，頭后仰，常規碘伏消毒鋪巾，穿刺進針點局部浸潤麻醉后，右手持一次性吸引活檢針，超聲引導下將細針穿入目標結節，拔出針芯，穿刺針在結節內沿不同方向前后快速穿插數次，通過虹吸原理吸取甲狀腺結節細胞，囊實性結節穿取實性部位細胞，穿刺標本分別立即行CS、LBC和BRAFV600E基因檢測。穿刺標本行CS后采用95%無水乙醇濕法固定，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色[5]，德國萊卡光學顯微鏡下行細胞學診斷。

穿刺標本直接注入30 ml細胞保存液中，離心后去上清液，去除膠質、黏液和血細胞成分，利用全自動液基細胞制片儀制片、封片和HE染色，德國萊卡光學顯微鏡下行細胞學診斷。

穿刺標本注入含800 μl RNA later保存液的PCR管中以進行BRAFV600E基因檢測。采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進行DNA分離，提取樣本基因組DNA，然后通過qRT-PCR進行基因擴增，采用擴增阻滯突變系統法和BRAFV600E基因突變試劑盒進行BRAFV600E基因檢測。

1.3 診斷標準

所有患者檢測后均行手術治療，手術中切除的甲狀腺結節標本均行組織病理學診斷，以組織病理學診斷結果為金標準。分析CS、LBC及BRAFV600E基因單獨檢測及LBC與BRAFV600E聯合檢測對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價值。根據甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統定義、標準和注釋[6]，將甲狀腺細胞病理學診斷分為6類：Thyl，標本無法診斷或不滿意；Thy2，良性，包括結節性甲狀腺腫、甲狀腺增生、甲狀腺炎；Thy3，意義不明確的細胞非典型性病變，或意義不明確的濾泡性病變；Thy4，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Thy5，可疑惡性腫瘤；Thy6，惡性腫瘤。本研究將Thy2、Thy3和Thy4良性病變記為陰性，將Thy5、Thy6甲狀腺乳頭狀癌記為陽性。BRAFV600E突變型為陽性，BRAFV600E野生型為陰性。雙盲，由兩名高年資病理科醫師對病理學檢測結果進行判定。靈敏度=真陽性例數（/真陽性+假陰性）例數×100%，特異度=真陰性例數（/真陰性+假陽性）例數×100%，準確度=（真陽性+真陰性）例數/總例數×100%。

1.4 統計學方法

采用描述性統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示；計數資料以例數和率（%）表示。

2 結果

2.1 LBC與CS 檢測的甲狀腺細胞病理學特點

90例患者，術后病理診斷結果顯示40例患者為甲狀腺乳頭狀癌，50例為良性病變（10例合并橋本甲狀腺炎）。

顯微鏡下，CS背景較為模糊，血液、膠質及無定形物成分較多，濾泡細胞分布不集中、重疊堆積、出現多層排列現象，核溝、假包涵體、沙礫體等甲狀腺乳頭狀癌的特征性診斷結構模糊難辨，制片過程中導致細胞變形及退變（圖1）。顯微鏡下，LBC視野更加清晰，血液、膠質成分少，濾泡細胞集中且數量顯著增加，細胞呈單層小簇狀排列，惡性細胞以散在或擁擠的三維細胞團排列，視覺立體感增強，細胞核清晰，核仁易識別（圖2、圖3）。

2.2 CS、LBC、BRAFV600E 基因檢測單獨或聯合檢測對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價值

CS檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為72.50%（29/40）、96.00%（48/50）、85.56%（77/90）；LBC檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為85.00%（34/40）、98.00%（49/50）、92.22%（83/90）；BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為67.50%（27/40）、100%（50/50）、85.56%（77/90）；LBC聯合BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為95.00%（38/40）、98.00%（49/50）、96.67%（87/90）。（表1、表2）

圖1 CS 檢測甲狀腺乳頭狀癌病理活檢結果（HE染色，×200）

圖2 LBC 檢測甲狀腺乳頭狀癌病理活檢結果（HE染色，×200）

圖3 LBC 顯示甲狀腺細胞核內包涵體（HE染色，×400）

表1 CS和LBC單獨檢測甲狀腺乳頭狀癌的結果與病理診斷結果的對照

表2 BRAF V600E基因單獨檢測及LBC聯合BRAF V600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的結果與病理診斷結果的對照

3 討論

目前，FNAC在國外已成為評估甲狀腺結節性質的常規檢查手段，臨床應用呈現逐年遞增趨勢[7]。王丹[8]研究分析甲狀腺結節FNAC診斷靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷準確度分別為96.67%、89.74%、87.8%、92.7%、92.7%，表明FNAC是術前診斷甲狀腺結節性質的可靠方法。FNAC穿刺后行CS，由于穿刺針上細胞沒有完全涂在玻片上，部分細胞隨穿刺針丟棄；人為因素致涂片過厚、涂片不均勻，或涂片過程中細胞過度風干[9]；穿刺結節血供豐富，使穿刺針中紅細胞或膠質過多，嚴重稀釋濾泡細胞，以上等因素均可使涂片不滿意，導致診斷效能下降。因此，解決CS不滿意的方法之一是細胞病理學醫師床邊快速制片、閱片或檢測涂片的質量，但這需耗費病理科大量人力，實施難度大。而LBC檢測將穿刺標本沖洗至細胞保存液中，多次振蕩離心后，去除標本中血細胞、膠質、細胞碎片等干擾成分，液基自動制片儀器制片，將濃縮細胞及診斷成分黏附于載玻片上約直徑13 mm范圍內，可以提高診斷效能[10-11]。LBC最早應用于婦科宮頸疾病診斷，并得到了充分肯定；近年LBC也廣泛應用于非婦科疾病領域，如胸腹腔積液、心包積液、痰標本、支氣管鏡刷洗[11-12]，在甲狀腺結節診斷中也取得了良好的效果。

根據文獻報道，LBC與CS兩種方法診斷甲狀腺結節良惡性的診斷效能分別為94.44%～97.50%和85.56%～90.45%[13]。本研究結果顯示，CS檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為72.50%、96.00%、85.56%；LBC檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為85.00%、98.00%、92.22%；LBC對甲狀腺乳頭狀癌的診斷效能均較高，有較好的臨床應用價值。但LBC制片過程中存在振蕩、離心會引起細胞簇的分散，出現大量單個細胞，且對細胞質有一定影響，導致核質比例增大，出現大量裸核，影響了診斷準確度[1]。

BRAF基因突變在甲狀腺乳頭狀癌中極為常見[14]。BRAF基因可將細胞外刺激信號轉導至細胞內，引起一系列細胞反應，從而調控細胞增殖、分化、凋亡、轉移等功能[14-16]。據文獻報道，BRAFV600E突變在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺未分化癌中檢出率分別為29%～83%、10%～24%[17]，本研究結果顯示，BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌靈敏度和準確度分別為67.50%和85.56%，與黃美玲等[18]研究結果相似。BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的特異度為100%，因為在正常甲狀腺組織、良性結節、濾泡性腺癌及髓樣癌中均未能檢測到BRAFV600E突變[19]。LBC聯合BRAFV600E基因檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度、特異度、準確度分別為95.00%、98.00%、96.67%，提高了BRAFV600E基因單獨檢測甲狀腺乳頭狀癌的靈敏度和準確度，值得推廣使用。甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E基因突變可以作為甲狀腺乳頭狀癌的高危因素及獨立的預后因子[20]。Lee等[21]通過Meta分析顯示BRAFV600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌組織侵襲力高，易向甲狀腺外浸潤、區域淋巴結轉移，臨床病理分期更高。

綜上所述，LBC技術對診斷甲狀腺乳頭狀癌具有良好的準確度和特異度，BRAFV600E基因檢測診斷具有高特異度，兩者聯合使用，能進一步提高術前對甲狀腺乳頭狀癌診斷準確度，指導臨床治療，并且兩者檢測操作可行性強、創傷小，臨床上值得推廣應用。