NRP2mAb 對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及黏附作用的影響研究

楊愛潔，李鵬，于潔，王凱，閻超#

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院青島院區(qū)放療科，山東 青島 266000

2青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，山東 青島 266000

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，乳腺癌患者的整體療效得到了明顯提高，但患者術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，晚期乳腺癌患者的病死率居高不下。而乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)有助于臨床采取合理的診療措施，進(jìn)而改善患者的預(yù)后。神經(jīng)纖毛蛋白2（neuropilin 2，NRP2）屬于一種糖蛋白分子，其分子量為110～140 kD，定位于染色體2q34，與淋巴系統(tǒng)密切相關(guān)，能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。NRP2在淋巴系統(tǒng)形成中發(fā)揮著重要作用，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在乳腺癌、肺癌、胃腸道惡性腫瘤、膠質(zhì)瘤及生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，NRP2存在廣泛表達(dá)[1]。相關(guān)研究顯示，NRP2在乳腺癌中高表達(dá)，參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，與乳腺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。NRP2單克隆抗體（neuropilin 2 monoclonal antibody，NRP2mAb）能夠?qū)RP2結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行抑制，從而抑制其相關(guān)生物學(xué)功能。本研究探討了NRP2mAb對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231）、NRP2mAb均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司，纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）購(gòu)自美國(guó)R&D公司，吉姆薩染色液購(gòu)自北京索萊寶公司；多孔板購(gòu)自美國(guó)Costar公司，Transwell-24膜嵌套（小室）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，DYY-8C型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠，CX31顯微鏡及FV1000激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自德國(guó)Partec GmbH公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MDA-MB-231細(xì)胞置于37℃溫水中，1200r/min離心5 min后，置于孵育箱中培養(yǎng)復(fù)蘇；而后經(jīng)細(xì)胞傳代處理后凍存。

1.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

以含10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、NaHCO3、青霉素、氯霉素的DMEM培養(yǎng)基制成MDA-MB-231單細(xì)胞懸液，取200 μl單細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為3000/孔，接種于48孔板中；隨后將其分為5組，每組8孔，分別采用25、50、75、100、200 μg/ml的NRP-2mAb處理5組MDA-MB-231細(xì)胞，隨后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d。采用 CCK-8法對(duì) NRP2mAb處理 24、48、72 h時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)2%FBS饑餓處理1天，消化、洗滌及離心處理后，采用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取MDA-MB-231細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，同時(shí)分別采用0、25、50、75 μg/ml的 NRP2mAb 處理 MDA-MB-231細(xì)胞，在Transwell小室下室中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2天；移去小室內(nèi)培養(yǎng)基，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，并以棉簽擦凈未遷移的MDA-MB-231細(xì)胞，采用瑞氏吉姆薩染色、處理15 min后，采用PBS洗滌2次，在光鏡下對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)2%FBS饑餓處理1天，消化、洗滌及離心處理后，采用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；Transwell小室上室內(nèi)鋪基質(zhì)膠，取MDA-MB-231細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，后續(xù)處理同“1.4”細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；采用吉姆薩染色處理后對(duì)MDA-MB-231遷移數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)消化、洗滌及離心處理后，采用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液；采用20 μg/ml的FN包被48孔板，風(fēng)干后采用PBS洗滌3次，每次20 min；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，分別接種于未經(jīng)FN包被（無FN處理組）和經(jīng)FN包被（FN處理組）的48孔板中，采用0、25、50、75 μg/ml的NRP2mAb分別處理接種于經(jīng)FN包被的48孔板中的MDA-MB-231細(xì)胞30 min，PBS洗滌，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；經(jīng)4%多聚甲醛固定后采用顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRP2mAb對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

NRP2mAb處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則，存在皺縮、脫落改變，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)顆粒數(shù)量增多。不同濃度NRP2mAb（25、50、75、100、200 μg/ml）處理24、48、72 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.474、14.376、19.778，P＜ 0.05）；且隨著NRP2mAb濃度的增高，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增高；但100μg/ml和 200μg/ml NRP2mAb處理24、48、72 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著NRP2mAb作用時(shí)間的延長(zhǎng)，乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增高；NRP2mAb處理24、48、72 h 后，同一濃度 NRP2mAb（25、50、75 μg/ml）處理的MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異均有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.116、6.112、6.052，P＜0.05）。（表1）

表1 不同濃度NRP2mAb處理后MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表1 不同濃度NRP2mAb處理后MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：a與25 μg/ml組比較，P＜0.05；b與50 μg/ml組比較，P＜0.05；c與75 μg/ml組比較，P＜0.05

NRP2mAb（μg/ml）24 h48 h72 h 256.75±2.1222.00±7.2923.62±7.15 5023.73±4.67a46.96±19.98a50.12±19.86a 7560.37±8.43a b73.63±14.26a b81.79±13.75a b 10088.96±6.64a b c90.00±6.06a b c93.54±7.01a b c 20091.29±6.59a b c91.37±6.59a b c97.08±4.20a b c

2.2 NRP2mAb對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

不同濃度NRP2mAb（0、25、50、75 μg/ml）處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=168.295、333.602，P＜0.01）；且隨著NRP2mAb濃度增高，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均逐漸減少，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同濃度NRP2mAb處理后MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲情況的比較（±s）

表2 不同濃度NRP2mAb處理后MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲情況的比較（±s）

注：a與0 μg/ml組比較，P＜0.05；b與25 μg/ml組比較，P＜0.05；c與50 μg/ml組比較，P＜0.05

NRP2mAb（μg/ml） 遷移數(shù)目 侵襲數(shù)目0 245.2±35.2232.8±33.1 25167.2±42.5a97.5±22.5a 50104.5±17.6a b72.4±15.4a b 7568.1±9.1a b c48.6±10.8a b c

2.3 NRP2mAb對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞黏附能力的影響

無FN處理組和不同濃度NRP2mAb處理后FN處理組MDA-MB-231細(xì)胞的黏附率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.046，P＜0.01）；與無FN處理組比較，0 μg/ml NRP2mAb處理的FN處理組MDA-MB-231細(xì)胞的黏附率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；FN處理組中，隨著NRP2mAb濃度（0、25、50、75 μg/ml）的增加，MDA-MB-231細(xì)胞的黏附率逐漸降低，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同濃度NRP2mAb處理后MDA-MB-231細(xì)胞黏附率的比較（%，±s）

表3 不同濃度NRP2mAb處理后MDA-MB-231細(xì)胞黏附率的比較（%，±s）

注：a與無FN處理組比較，P＜0.05；b與0 μg/ml組比較，P＜0.05；c與25 μg/ml組比較，P＜0.05；d與50 μg/ml組比較，P＜0.05

組別 黏附率無FN處理組22.5±6.5 FN處理組0 μg/ml NRP2mAb45.5±11.8a 25 μg/ml NRP2mAb27.2±8.6b 50 μg/ml NRP2mAb22.5±5.1b c 75 μg/ml NRP2mAb18.1±4.8b c d

3 討論

NRP2是神經(jīng)纖毛黏連蛋白家族的重要成員之一，與神經(jīng)纖毛蛋白 1（neuropilin 1，NRP1）具有44%的同源性[3]。作為一種跨膜蛋白，NRP2包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部位。NRP2受體廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，并參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲及凋亡過程[4-6]。已有研究顯示，NRP2是重要的抗腫瘤靶點(diǎn)之一，NRP2與CXC趨化因子受體 4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）存在信號(hào)通路的部分重疊，在乳腺癌患者中，抑制NRP2表達(dá)可以下調(diào)腫瘤組織中CXCR4的表達(dá)，提示兩者之間可能存在一定的相關(guān)性[7]。NRP2在乳腺癌細(xì)胞、腫瘤血管及淋巴管中均呈高表達(dá)，且明顯高于正常組織[8-10]。

NRP2是近年來發(fā)現(xiàn)的一種VEGF受體，可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)新生毛細(xì)血管的生成[11]。乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、黏附是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的重要原因，研究表明，下調(diào)NRP2表達(dá)可能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，減少腫瘤新血管生成[12]。正常生長(zhǎng)的乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)清晰，貼壁性較高。本研究結(jié)果顯示，NRP2mAb處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量減少、邊緣皺縮、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞質(zhì)顆粒增多及細(xì)胞脫落，表明NRP2mAb能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖；同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著NRP2mAb濃度的增高（25、50、75、100、200 μg/ml），MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增高；但 100 μg/ml和 200 μg/ml NRP2mAb 處理24、48、72 h后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；表明高濃度（100～200 μg/ml）NRP2mAb 可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

NRP2mAb對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用還表現(xiàn)在對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲的作用[13]，本研究結(jié)果顯示，不同濃度 NRP2mAb（0、25、50、75 μg/ml）處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且隨著NRP2mAb濃度的增高，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均逐漸減少（P＜0.05）。表明NRP2mAb能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲，且其抑制程度具有明顯的濃度依賴性。究其原因可能為NRP2mAb通過阻止Smad2/3的磷酸化過程而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，而通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達(dá)，干擾乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲過程。

FN能夠提高乳腺癌細(xì)胞的黏附能力，使腫瘤細(xì)胞聚集和黏附，形態(tài)飽滿，貼壁性好。本研究結(jié)果顯示，與無FN處理組比較，0 μg/ml NRP2mAb處理后FN處理組MDA-MB-231細(xì)胞的黏附率增高（P＜0.05）；FN處理組中，隨著NRP2mAb濃度（0、25、50、75 μg/ml）的增加，MDA-MB-231細(xì)胞的黏附率逐漸降低（P＜0.05）。表明FN可以提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞的黏附能力，而NRP2mAb可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞的黏附能力，且該作用具有濃度依賴性，隨NRP2mAb濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。采用NRP2mAb處理后，乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，呈現(xiàn)不同程度皺縮而形態(tài)不規(guī)則，并存在一定的脫落現(xiàn)象。NRP2mAb主要通過抑制乳腺癌細(xì)胞應(yīng)力纖維的形成、減少腫瘤細(xì)胞間交聯(lián)作用而抑制其黏附過程，而NRP2mAb對(duì)整合素α5β3及黏著斑激酶的抑制作用是該作用的重要環(huán)節(jié)[12,14]。

綜上所述，NRP2mAb對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及黏附能力均有抑制作用，并且具有濃度依賴性。