磁性殼聚糖微球固定化漆酶的制備及酶學性質研究

楊 捷，王夢祎，林沚葳，林 娟，葉秀云

(福州大學生物科學與工程學院,福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州 350108)

0 引言

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的高效氧化酶，可以催化各種芳香族化合物的氧化[1].漆酶在自然界中廣泛存在，其中關于白腐真菌漆酶的研究最多[2].大多數漆酶產生菌產量低，且漆酶在工業條件下容易失活，使其在實際應用中受到限制.酶的固定化可以實現酶制劑的重復利用，降低使用成本，并增強其操作穩定性[3].酶的固定化方法主要有包埋、吸附、交聯等；已經用于漆酶固定化的載體包括納米材料、介孔材料、凝膠和親水性微濾膜等[1]，其中納米材料因其大的比表面積，良好的生物相容性和催化效果成為近年來的研究熱點[4].此外，也有使用雙功能交聯劑(例如戊二醛)直接無載體固定化漆酶的報道，但該方法得到的固定化漆酶機械強度差、回收困難[5].

近年來，使用納米磁性體吸附脂肪酶、β-D-半乳糖苷酶、醇脫氫酶和漆酶[6-9]，都顯示出了良好的固定化效果.為了避免磁芯的磁誘導自聚集，在這些納米顆粒上附加無機或聚合物涂層，可以提高這些納米結構的功能性或生物相容性[10-11].天然高分子凝膠載體(如殼聚糖、海藻酸鈣等)以及有機合成聚合物(如聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺等)，由于表面具有功能基而經常被用作制備載體的基礎材料[1].其中，殼聚糖(β-1,4-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖)是一種氨基多糖，其分子鏈上的氨基(-NH2)和羥基(-OH)易于進行化學改性作為與生物結合的活性位點.殼聚糖具有低成本、可生物降解、良好生物相容性和無毒等優點，被廣泛應用于水處理、酶固定等領域[12-13].

已有一些以殼聚糖或以磁性納米粒子作為載體固定化漆酶的報道，而以硅烷化的磁性Fe3O4-殼聚糖為載體、戊二醛為交聯劑固定漆酶卻鮮見報道.本實驗室前期獲得一株齒毛菌菌株(Cerrenasp.HYB07)，具有漆酶產量高、催化活性強、穩定性好等優點和染料脫色能力[14].本研究以磁性Fe3O4-殼聚糖微球為載體，戊二醛為交聯劑固定Cerrenasp.HYB07菌株制備的漆酶.探討其固定化條件、酶學性質和對蒽醌染料活性亮藍(remazol brilliant blue R,RBBR)的脫色效果，為固定化漆酶的應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗室保存的Cerrenasp.HYB07作為漆酶來源，漆酶的發酵制備參考實驗室前期所述[15]進行.ABTS購買于美國Sigma公司；殼聚糖、戊二醛、硝酸汞等試劑均為國產分析純，購自國藥化學試劑有限公司.

1.2 酶活力測定

以ABTS為底物，在40 ℃下測定反應體系(pH=3.0)在420 nm處的吸光度變化.以每分鐘催化1 μmol 底物氧化所需酶量為一個酶活力單位(U)，并計算固定化率.

固定化率(%)=(加入的酶總活力-上清液的酶總活力)/加入的酶總活力×100

1.3 磁性殼聚糖微球固定化漆酶的制備

磁性Fe3O4納米粒子的制備參考Dung等[16]的方法，在60 ℃下，用25%(體積分數)的NH3·6H2O共沉淀Fe2+(FeSO4·7H2O)和Fe3+(FeCl3·6H2O)獲得.然后用15%(體積分數)的3-氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化Fe3O4納米粒子，獲得100～200 nm的磁性Fe3O4顆粒.將硅烷化的磁性Fe3O4納米顆粒添加到10 mL含有30 mg·mL-1殼聚糖溶液中攪拌均勻.用內徑為0.4 mm的注射器將膠體逐滴加到1 mol·L-1NaOH中以形成Fe3O4-殼聚糖微球.用蒸餾水反復沖洗至中性，真空抽濾、干燥.

取一定質量的Fe3O4-殼聚糖微球載體與戊二醛交聯，然后與漆酶酶液混合，置于25 ℃的恒溫搖床上振蕩一段時間后過濾上清液，用蒸餾水反復沖洗至沖洗液檢測不出酶活.利用單因素實驗分別對磁性Fe3O4納米顆粒添加量(0.2、0.4、0.8、1.2 μg·mL-1)、戊二醛質量濃度(2、4、8、12、16 mg·mL-1)、戊二醛交聯時間(2、4、8、12、16 h)、酶固定化時間(2、4、6、8、12、16 h)、給酶量(20、40、80、160、320 U·mL-1)進行優化.以ABTS為底物，測定固定化酶活力和固定化率.所有數據均為3次平行實驗的平均值，圖中誤差線為3次平行實驗的標準差.

1.4 固定化漆酶性質的測定

1)最適pH值及最適溫度.在40 ℃下，不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液中測定酶活力，確定最適pH值.在最適pH值下，不同溫度的恒溫水浴鍋中測定酶活力，確定最適溫度.以最高酶活作為100%，每個樣品做3次平行測定，取平均值.

2)熱穩定性.將游離酶、固定化酶分別置于不同溫度下(50～70 ℃)保溫一段時間(0～6 h)，測定剩余酶活力，以保溫前的酶活作為100%.利用生物統計分析軟件GraphPad Prism version 5.0求游離酶和固定化酶的熱失活半衰期t1/2.

3)動力學常數.在最適pH值和最適溫度下，測定游離酶和固定化酶對不同濃度ABTS(2.5～250.0 μmol·L-1)的反應速率.利用GraphPad Prism version 5.0進行非線性回歸，求得游離酶和固定化酶的的米氏常數Km和最大速度vmax.

1.5 建立批次模式酶反應器

圖1 批次模式酶反應器流程圖Fig.1 Batch mode enzymatic reactor

實驗構建一個酶生物反應器(見圖1).該反應器由原料集液器、調節流速蠕動泵、填充了固定化漆酶的聚丙烯管和出口收集器組成，以等量空載體為空白對照.配制RBBR溶液(100 mg·L-1，pH= 4.5)，以0.3 mL·min-1的流速通過生物酶反應器，10 mL為一批次單位.收集反應后產物溶液，在RBBR最大吸收峰(594 nm)下測定產物吸光值，以初始RBBR的吸光值作為100%對照.從酶反應器中回收固定化酶，用去離子水沖洗3次后再投入反應器中，重復10次.

1.6 Hg2+存在下對漆酶RBBR脫色過程的追蹤

在不同Hg(NO3)2濃度(0、0.2、0.5、1.0 mmol·L-1)下，測定游離酶和固定化酶(0.825 U·mL-1)對RBBR(100 mg·L-1，pH=4.5)的脫色.每個樣品做3次平行測定.

2 結果與討論

2.1 固定化漆酶制備條件的優化

漆酶的固定化率和固定化酶活力都隨著磁性Fe3O4添加量的增加先上升后下降(見圖2(a)).當磁性Fe3O4的添加量為0.4 μg·mL-1時，固定化率和固定化酶活力達到最高.當戊二醛質量濃度小于4 mg·mL-1、交聯時間小于12 h時，固定化率和固定化酶活力都隨戊二醛質量濃度的增加而增大(見圖2(b)、(c)).將戊二醛質量濃度進一步增加至16 mg·mL-1，漆酶固定化率無任何顯著增加，且固定化酶活力逐漸降低.同樣地，交聯時間延長至16 h，固定化率和固定化酶活力也并未增加.交聯劑濃度過高和交聯時間過長，都可能影響酶分子活性位點的三維結構，從而降低酶活[17].因此，選擇4 mg·mL-1的戊二醛交聯12 h進行之后的實驗.固定化8 h以內，固定化率和固定化酶活力隨固定化時間的延長而增大，之后趨于平緩(見圖2(d)).雖然在16 h達到最大固定化率89.82%，但是固定化酶活力較8 h時并未增加.因此將8 h作為最優酶固定化時間.漆酶的固定率隨給酶量的增大而減小，而固定化酶的酶活力隨著給酶量的增加而增加(見圖2(e)).當給酶量為160 U·mL-1時，固定化酶活力為97.19 U·g-1，此時固定化率為78.03%.當給酶量繼續提高到320 U·mL-1時，固定化酶活力并未有顯著提高.因此，選擇160 U·mL-1作為最佳給酶量.

圖2 固定化酶的單因素優化Fig.2 Single factor optimization on immobilized laccase

曹文娟等[17]利用殼聚糖-戊二醛交聯法固定化漆酶，固定化效率只達到56%.Das等[18]用磁性殼聚糖納米粒子固定化漆酶獲得了65%～70%的固定化率，考慮可能是其磁性Fe3O4沒有硅烷化改性，限制磁性納米顆粒與酶分子的耦聯.而Wang等[19]利用與本實驗相似的方法固定化漆酶，最大活性回收率只達到55.2%.而本實驗在引入磁性Fe3O4納米粒子后，提高了酶的固定化率，顯示出納米材料的優異效果.

2.2 固定化漆酶性質與應用2.2.1 最適pH值和最適溫度

游離酶的最適pH值為3.0，如圖3(a)所示.固定化酶在pH=2.5的情況下酶活升高，主要因為殼聚糖分子會溶于酸性條件中，導致部分沒有和戊二醛交聯的殼聚糖發生溶解，表現出酶活升高的假象.在pH=3.0的反應條件下沒有發現殼聚糖溶解情況，因此后續以3.0作為固定化酶的最適pH值.

游離酶和固定化酶的最適反應溫度分別為40 ℃和45 ℃，如圖3(b)所示.相對于游離漆酶，固定化酶的作用溫度更寬.例如，在30～55 ℃之間，固定化酶的相對酶活力都保持在80%以上.在60 ℃時，固定化酶還有34%的相對酶活力，而游離酶的酶活基本喪失.

圖3 游離酶和固定化酶的最適反應pH值和溫度Fig.3 Effect of pH value and temperature on free laccase and immobilized laccase

2.2.2熱穩定性

圖4所示是游離酶和固定化酶在不同溫度下的酶活力變化曲線.隨著溫度逐漸升高，固定化酶與游離酶的失活速率都逐漸變大.但是，在同一溫度下固定化酶相對于游離酶的熱失活速率都更緩慢，熱失活半衰期延長，如表1所示.由于工業生產使用過程中所需的高溫條件，固定化漆酶熱穩定性的提高將是其工業應用的一大優勢[20].

圖4 游離酶和固定化酶的熱穩定性曲線Fig.4 Thermal stability curve of free laccase and immobilized accase

表1 游離酶和固定化酶的熱失活半衰期(t1/2)Tab.1 Thermal inactivation half-life (t1/2)for free laccase and immobilized laccase

2.2.3動力學常數

使用ABTS作為底物，利用GraphPad Prism version 5.0進行非線性回歸，求游離酶和固定化酶的米氏常數Km和最大速度vmax，結果列于表2.實驗結果顯示，酶固定化對底物親和力影響不大，這與一般固定化酶會降低對ABTS的親和力的報道不同[6,18].

表2 游離酶和固定化酶對底物ABTS的動力學參數Tab.2 Kinetic parameters of free laccase and immobilized laccase with ABTS as the substrate

2.2.4固定化酶對RBBR脫色的重復利用性

圖5 固定化酶的重復利用性Fig.5 Immobilized laccase repeatability

前期工作中發現Cerrenasp.HYB07漆酶對RBBR脫色效果顯著[21].將制備的固定化漆酶用于批次進樣的酶生物反應器中進行RBBR脫色，結果如圖5所示.磁性Fe3O4-殼聚糖固定化酶在7次內對RBBR脫色率都保持在90%以上，且重復10次進樣后脫色率仍有77.38%.固定化酶的載體本身具有吸附能力，顯示出一定的脫色效果，但隨著重復次數的增加，吸附能力越來越低，直至第10次進樣幾乎沒有脫色效果.本實驗制備的固定化酶對染料RBBR具有良好的重復利用性.

2.2.5Hg2+對漆酶介導的RBBR脫色的影響

在不同Hg2 +濃度(0～1.0 mmol·L-1)下追蹤游離酶和固定化酶對RBBR的脫色過程，結果如圖6所示.汞離子的存在對游離酶介導的RBBR的脫色明顯抑制而固定化漆酶依舊顯示出良好的脫色效果.因此，本實驗制備的固定化漆酶在實際工業廢水處理中更具競爭力.

圖6 Hg2+對游離酶和固定化酶脫色進程的影響Fig.6 Effect of Hg2+ on the decolorization process of free laccase and immobilized laccase

3 結語

本研究通過合成磁性Fe3O4-殼聚糖微球，戊二醛交聯制備固定化漆酶，最優條件下固定化率達到78.03%.與游離酶相比，固定化漆酶熱穩定性更好.固定化酶具有良好的重復利用性，且汞離子存在下仍效果良好.因此，磁性殼聚糖微球固定化漆酶具有良好的應用潛力.