HGF/c-met 信號通路對乳腺癌上皮-間充質轉化的影響研究△

劉海旺，張宏旭，劉燃，郝美玲，王軍，李春輝

承德醫學院附屬醫院1病理科，2乳腺外科，3麻醉科，河北 承德 067000

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，每年新發病例超過150萬例，造成約50萬例患者死亡[1]。然而乳腺癌發生和發展的分子機制復雜，仍不是十分清楚。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種由間質細胞分泌的多功能生長因子，由兩個亞基組成，是含有728個氨基酸的肝素結合糖蛋白[2]。c-met是原癌基因met編碼的蛋白質產物，其目前已知的唯一天然配體是HGF，故也被稱為HGF受體，屬于受體酪氨酸激酶家族[3]，HGF與cmet結合可以激活酪氨酸激酶活性，在肝癌、小細胞肺癌、胃癌及卵巢癌等多種癌癥中被證實具有較強的誘導上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成，促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等作用[4]。目前以經其他通路誘導的乳腺癌EMT研究較多[5]，而HGF/c-met信號通路對乳腺癌EMT影響的研究較少。本研究擬通過對HGF、c-met及乳腺癌EMT相關蛋白的檢測，探討HGF/c-met信號通路與乳腺癌EMT的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2018年12月于承德醫學院附屬醫院進行乳腺癌或乳腺纖維腺瘤切除患者的病歷資料。納入標準：①所有患者經術后病理檢查明確診斷，為乳腺癌或乳腺纖維腺瘤；②患者臨床資料和病理資料記錄規范、準確、完整；③未合并其他腫瘤或有腫瘤史。排除標準：①乳腺癌復發者；②彌漫性病變、留取標本不合格者。根據納入、排除標準，本研究共納入80例乳腺癌及80例乳腺纖維腺瘤切除患者。所有患者均為女性，乳腺癌組中，年齡38～64歲，平均（51.26±5.15）歲；乳腺纖維腺瘤組中，年齡35～62歲，平均（48.93±5.82）歲。兩組患者年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會審查并通過。選取80例乳腺癌患者和80例纖維腺瘤患者的手術標本進行研究，分別作為乳腺癌組及纖維腺瘤組，另選取乳腺癌組患者對應的正常乳腺組織（腫瘤邊緣＞5 cm區域）作為正常乳腺組（80例）。

1.2 檢測指標及試劑

檢測所有標本的6種蛋白指標，分別為HGF、c-met、上皮鈣黏素（E-cadherin）、β-聯蛋白（β-catenin）、Vimentin及Snail。所有免疫組化試劑盒均購自上海研生實業有限公司。

1.3 免疫組化檢測方法

所有操作嚴格按照本實驗室標準化操作流程，由2名經驗豐富的病理科醫師進行。①內源性過氧化酶滅活：標本石蠟包埋連續切片4 μm，3%H2O2室溫孵育10 min；②抗原修復：切片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗5 min，再放入0.01 mol/L（pH值為6.0）的枸櫞酸鹽緩沖液中置于微波爐10 min；③封閉：加入正常山羊血清工作液，37℃濕盒溫育60 min；④一抗：滴加鼠抗抗體（一抗），37℃濕盒中孵育60 min，在濕盒中4℃過夜；⑤二抗：PBS沖洗5 min，重復3次，滴加酶標羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）聚合物（二抗），室溫孵育15 min，再次用PBS沖洗切片3次，每次5 min；⑥顯色：滴加二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染核3 min，樹膠封片，觀察。每批實驗設置陰性對照（組織切片用PBS替代一抗，其余染色步驟相同）和陽性對照（廠家提供的陽性切片）。

1.4 結果判定標準

結果判讀由2名經驗豐富的病理科副主任醫師獨立進行，當結果不一致時再重復判讀或由上級醫師閱片判定。所有待檢測蛋白均以待檢細胞的細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒為陽性，陽性表達強弱判斷標準按陽性細胞百分比及著色強度評價。①陽性細胞百分比：選擇染色均勻的腫瘤區域，在400倍視野下計數陽性細胞占視野細胞總數的百分比，共計數5個視野，取平均值，無陽性細胞為0分，＜25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。②著色強度：不著色為0分，著色弱為1分，中等著色為2分，著色強為3分。陽性細胞百分比評分與著色強度評分相加為總評分，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中度陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。其中c-met強陽性（+++）作為c-met高表達，其余為c-met低表達。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，3組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或連續校正法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.13 組組織中6種蛋白表達量的比較

3組組織中HGF、c-met、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Snail表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；乳腺癌組組織中HGF、c-met、Vimentin、Snail表達量均高于纖維腺瘤組及正常乳腺組，E-cadherin、β-catenin表達量均低于纖維腺瘤組及正常乳腺組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；正常乳腺組HGF表達量高于纖維腺瘤組，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 3組組織中6種蛋白表達量的比較

2.2 乳腺癌組織中c-met 高表達與低表達患者臨床特征的比較

c-met高表達患者發生淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化的比例均高于c-met低表達患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；c-met高表達與低表達患者年齡、原發灶長徑、雌激素受體及新輔助化療比例比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 乳腺癌組織中c-met高表達與低表達患者臨床特征的比較

2.3 乳腺癌組織中c-met 高表達與低表達患者EMT 相關蛋白表達量的比較

c-met高表達患者E-cadherin和β-catenin表達量均明顯低于c-met低表達患者，Vimentin和Snail表達量均明顯高于c-met低表達患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 乳腺癌組織中c-met高表達與低表達患者EMT相關蛋白表達量的比較（±s）

表3 乳腺癌組織中c-met高表達與低表達患者EMT相關蛋白表達量的比較（±s）

分層E-cadherin β-catenin Vimentin Snail c-met高表達（n=56）c-met低表達（n=24）t值P值4.11±0.35 4.91±0.38 9.131 0.000 4.30±0.56 4.77±0.53 3.494 0.001 3.58±0.52 2.31±0.49 10.180 0.000 3.82±0.47 2.29±0.36 14.239 0.000

3 討論

腫瘤發病機制十分復雜，涉及的分子眾多，一直是各國學者研究的熱點。從分子水平上解析乳腺癌的發病機制，是發現新治療靶點的一個重要途徑[6]。EMT是上皮來源的惡性腫瘤中廣泛存在的一種分子病理改變，它使上皮源性腫瘤細胞的上皮標志物表達下調，并獲得間質細胞表型，從而得到更強的侵襲和轉移能力[7]。EMT的誘導機制較為復雜，據文獻報道，多種信號通路均對乳腺癌EMT過程有一定的影響，而HGF/c-met信號通路與乳腺癌EMT的關系研究報道較少[8-11]。

本研究結果顯示，乳腺癌組HGF、c-met表達量均高于纖維腺瘤組及正常乳腺組，提示HGF/c-met信號通路在乳腺癌中表達上調。而正常乳腺組HGF表達量高于纖維腺瘤組，這與Veenstra等[12]的實驗結果不符?？赡苁怯捎诒狙芯空Ｈ橄俳M取材于癌灶附近，而HGF在正常生理狀態下于全身各處都有表達，主要由間充質細胞以自分泌和旁分泌的方式表達、起效[13]，從而使本研究中的正常乳腺組中HGF/c-met表達偏高。

另外本研究選擇了4種EMT相關蛋白，其中E-cadherin和β-catenin是上皮細胞間典型的黏附分子，細胞骨架肌動蛋白之間的連接者。Sommerova等[14]研究表明，當E-cadherin表達下調時，E-cadherin/β-catenin復合體不穩定并解離，上皮間黏附力減弱，同時β-catenin可從膜上釋放入細胞質，激活Wnt信號通路誘導腫瘤細胞出現EMT的相關改變。本研究結果顯示，乳腺癌組織中E-cadherin和β-catenin表達量均低于纖維腺瘤組及正常乳腺組。Vimentin是間質細胞的特征性成分，其通常不表達在上皮細胞中，是腫瘤EMT常見的指標[15]。Snail是一種鋅指蛋白，其通過下調E-cadherin等上皮細胞標志物和上調間質細胞標志物的表達，極大地促進腫瘤細胞EMT[16]。本研究結果顯示，乳腺癌組織中Vimentin和Snail表達量均高于纖維腺瘤組及正常乳腺組，提示乳腺癌細胞存在EMT傾向。

本研究結果顯示，c-met高表達患者E-cadherin和β-catenin表達量均明顯低于c-met低表達患者，提示c-met高表達患者的腫瘤細胞可能具有更高的侵襲和轉移能力。另外，c-met高表達患者Vimentin和Snail表達量均明顯高于c-met低表達患者，提示c-met高表達患者的腫瘤細胞具有更多的間充質細胞特征，其EMT的程度更高。從本研究的臨床特征分析，c-met高表達患者發生淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化的比例均高于c-met低表達患者，這與李樹斌和張延新[17]的研究結果類似。而低分化的乳腺癌組織間充質特征更加明顯，EMT程度更高，淋巴結轉移和遠處轉移的風險更高[18]，TNM分期就更高，這與結果中EMT相關蛋白表達量的結果吻合。提示，c-met高表達可能與腫瘤細胞的轉移、擴散行為有關[19]。

本研究采用免疫組化法對上述蛋白進行檢測，具有一定的局限性，只能對HGF/c-met信號通路與乳腺癌EMT的關系做一初步研究猜想。仍需要Western blott等更精確的方法進行定量，以及細胞實驗對HGF/c-met信號通路與乳腺癌細胞侵襲和轉移能力影響的直接觀察。

綜上所述，HGF/c-met信號通路可能通過下調上皮黏附分子、上調間充質分子標志物的表達，促進乳腺癌細胞EMT。