石斛合劑序貫法對糖尿病合并肝纖維化大鼠NF-κB信號表達的影響

張家林，林心君，周 勇，莊舒婷，施 紅

(福建中醫藥大學 中西醫結合學院，福建 福州 350121)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要特點為碳水化合物、脂類和蛋白質平衡失調，同時出現胰島素分泌受損、胰島素抵抗[1]。2型糖尿病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的危險因素，該疾病包括肝脂肪變性(非酒精性脂肪肝，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纖維化(HF)和肝硬化。許多前瞻性研究[2]表明，2型糖尿病和肝纖維化之間存在聯系。糖尿病的主要表現為高血糖，且越來越多研究表明其能明顯促進肝臟等器官纖維化的形成[3]。Ⅳ型膠原(ⅣC)與肝纖維化的程度關系密切，是構成基底膜的成分，反映基底膜膠原更新率，在肝纖維化時最早出現，可較靈敏地反映肝纖維化過程，因此可作為早期診斷的指標[4]。NF-κB是介導炎癥的經典通路，而肝纖維化主要由于炎癥介質激活肝形狀細胞活化而形成。本文通過討論石斛合劑對NF-κB信號通路的影響，以研究石斛合劑對2型糖尿病合并肝纖維化的抑制作用，為2型糖尿病合并肝纖維化的治療提供新的理論依據。

石斛合劑(現為福建省第二人民醫院院內制劑)序貫療法是施紅教授通過多年對糖尿病的臨床與基礎研究，不斷實踐與修正，總結出的獨特配方，臨床上常用于治療糖尿病及其并發癥。最新研究[5]表明，石斛合劑序貫法能夠有效改善2型糖尿病合并肝纖維化大鼠血糖，肝功能(ALT、AST)，血清肝纖維化四項(PC-Ⅲ、HA、Ⅳ-C、LN)，然而石斛合劑對2型糖尿病合并肝纖維化的作用機制不明。本文通過觀察2型糖尿病合并肝纖維化后的NF-κB信號表達，探討糖尿病合并肝纖維化的部分機制及石斛合劑的治療作用。

1 材料與試劑

1.1 動物

成年健康雄性SPF級Wistar大鼠40只，體重(200±10)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-00020，于福建中醫藥大學實驗動物中心飼養。該實驗符合中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求。采用隨機數表法將40只Wistar大鼠隨機分為正常對照組和模型組，模型組采用高脂高糖6W+STZ(25 mg/kg)造模，而后按照血糖、體重隨機分為模型對照組、二甲雙胍組、石斛合劑組，每組8只。

1.2 藥材與試劑

石斛合劑1方：石斛、黃芪、丹參、五味子、知母、葛根、生地黃、地龍組成。石斛合劑2方：茵陳、梔子、滑石、大黃、萹蓄、甘草組成，購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，加工成石斛合劑1方含生藥量1.7 g/mL，石斛合劑2方含生藥量1 g/mL，無菌保存于-20 ℃冰箱。一抗：兔抗大鼠IV型膠原抗體(購于Abcam，美國)、NF-κB P65(Cell Signaling Technology，美國)、NF-κB P50(Cell Signaling Technology，美國)、IκBβ(Cell Signaling Technology，美國)、IKKβ(Cell Signaling Technology，美國)、鼠抗β-actin抗體(Sigma，中國)、二抗：山羊抗兔、山羊抗鼠、鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組化試劑盒(購于碧云天生物技術研究所，中國)。

1.3 儀器

尼康生物顯微鏡(日本尼康公司，55I)；5417R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；電泳槽及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)；DU-650型蛋白分析儀(美國Beckman公司)。

2 方法

2.1 模型建立

根據課題組前期造模方法[5]，高脂飼料配方：60.7%基礎飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇、0.3%膽酸鹽，正常對照組予基礎飼料喂養，余大鼠予高脂飼料喂養6周后。隔夜禁食(12 h)，予1%的STZ(檸檬酸鈉緩沖液配制，pH=4.2～4.4)腹腔一次性注射(25 mg/kg)，續高脂飼料喂養。于注射后3天(72 h)后尾部采血測定血糖，若連續2次隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。按照體重、血糖分組后選取24只成模鼠，予40% CCL4(橄欖油配制)皮下注射(0.2 mL/100 g，2次/周，8周)，建立合并肝纖維化模型，并同時予相應藥物處置(見“2.2”項)。

2.2 干預方法

石斛合劑組給予石斛合劑1方灌胃7天，給藥劑量為17 g·kg-1·d-1，續給予石斛合劑2方灌胃3天，給藥劑量10 g·kg-1·d-1，循環灌胃，干預8周；二甲雙胍組給予二甲雙胍灌胃，給藥劑量為0.1 g·kg-1·d-1，干預8周；正常對照組、模型對照組給予等量0.9%NaCl溶液灌胃，干預8周。

2.3 取材

干預8周后，取材前隔夜禁食不禁水，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，剪開腹腔，腹主動脈采血，裝于抗凝真空采血管，并4 ℃離心制備血清，用于生化指標檢測。同時暴露肝臟，取出置于冰上，于預冷0.9%NaCl溶液中清洗，一部分0 ℃冰箱中保存行Western Blot檢測，余肝臟組織，用濾紙吸凈水分，置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化檢測。

2.4 檢測方法

2.4.1 血清學檢測 尾部采血測量空腹血糖，離心制備的血清按試劑盒說明書測定AST、ALT。

2.4.2 免疫組化 肝臟組織石蠟切片(厚度4 μm)常規脫蠟、入水；PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗，將玻片置于枸櫞酸鹽緩沖液微波輻射修復，自然冷卻到室溫；PBS沖洗5 min×3次；加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；PBS沖洗5 min×3次，加封閉血清，37 ℃恒溫孵育1 h；甩去組織表面封閉液，濾紙吸去殘留血清；滴加兔抗大鼠IV型膠原一抗(1∶200)，4 ℃過夜。第2日，室溫復溫30 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加羊抗兔二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，滴加鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，甩去PBS液，加2滴新鮮配制DAB染色液5 min，水洗，蘇木素復染，水洗，吹干，封片。采用尼康生物顯微鏡觀察。

2.4.3 Western blot檢測 每100 mg肝臟組織加入1 mL細胞裂解液和10 μL苯甲基硫酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，充分研磨，12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度。采用5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入NF-κB P65(1∶ 1 000)、NF-κB P50(1∶1 500)、IκBβ(1∶1 000)、IKKβ(1∶1 000)及β-actin(1∶ 1 000)一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜×3，加入二抗(1∶2 000辣根過氧化物標記)，室溫孵育1 h，避光顯影成像。采用Image-lab軟件進行條帶分析處理，以β-actin為內參。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠空腹血糖及血清肝功能指標比較

干預前，與正常對照組比較，模型對照組、二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠空腹血糖均明顯升高(P<0.05)。干預后，與模型對照組比較，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠空腹血糖明顯降低(P<0.05)。與干預前比較，干預后二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠空腹血糖水平明顯下降(P<0.05)。干預后，二甲雙胍組與石斛合劑組大鼠空腹血糖水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，以上結果說明石斛合劑能有效降低2型糖尿病合并肝纖維化大鼠血糖。見表1。

與正常對照組比較，模型對照組大鼠ALT、AST顯著升高，而二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠ALT、AST輕微升(P<0.05)。與模型對照組比較，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠ALT、AST明顯下降(P<0.05)，二甲雙胍組與石斛合劑組大鼠AST比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示石斛合劑能有效改善2型糖尿病合并肝纖維化肝功能(ALT、AST)的情況。見表2。

組別例數(n)干預前(mmol/L)干預后(mmol/L)正常對照組84.7±0.275.32±0.25#模型對照組819.82±6.17*16.64±2.18*二甲雙胍組820.94±5.38*6.7±2.63#△石斛合劑組819.36±6.74*7.55±2.71#△

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與干預前比較，△P<0.05。

組別例數(n)ALT(U/L)AST(U/L)正常對照組853.81±6.3176.44±6.25模型對照組8166.48±4.368*283.65±15.45*二甲雙胍組898.44±12.95*#106.08±16.14*#石斛合劑組880.44±17.29*#106.71±15.81*#

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。

3.2 肝組織Ⅳ型膠原(collagen-Ⅳ)免疫組化觀察

肝臟Ⅳ型膠原陽性表達反應呈淡黃色，主要分布在肝細胞外間質，細胞核呈藍染。正常對照組大鼠可見極少Ⅳ型膠原陽性表達沉積在細胞外間質，與正常對照組相比，模型對照組大鼠可見較多的Ⅳ型膠原陽性表達(P<0.05)。與模型對照組相比，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠Ⅳ型膠原陽性表達顯著減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 肝臟免疫組化Ⅵ膠原表達情況

3.3 Western blot檢測NF-κB P65、NF-κB P50、IKKβ、IκBβ蛋白表達

與正常對照組相比，模型對照組大鼠NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表達量顯著升高，IκBβ表達量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組相比，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表達均顯著降低，IκBβ表達量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，# P<0.05。

4 討論

肝臟是胰島素攝取和作用的器官，胰島素能促進肝臟糖原的合成并減少糖異生，當胰島素抵抗時，脂肪組織分解成游離脂肪酸增加，同時肝臟糖原合成及骨骼肌對血糖的攝取作用降低，最終不僅引發血糖升高甚至糖尿病，也會出現脂肪異位。許多研究表明，血糖升高及糖尿病會促進神經[6]、血管[7]、腎臟[8]纖維化及視網膜[9]發生病變。相關實驗證實高糖會引起肝星狀細胞活化增殖，促進肝纖維化[10]。

肝纖維化的特點為膠原纖維在肝細胞外間質過度沉積，而膠原纖維主要由肝星狀細胞合成，高血糖被認為是一種炎癥前狀態，更容易激活肝星狀細胞，合成膠原纖維[3]。在高糖狀態下，許多炎癥細胞因子大量產生，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1(IL-1)等，其能刺激肝星狀細胞活化，導致肝纖維化發生。在長期的高糖狀態下，蛋白質在體內容易反復糖基化，形成糖基化終末產物，從而與肝星狀細胞表面糖基化終末產物受體結合產生信號傳遞，促進一系列與肝纖維化發生有關因子產生，如血小板衍生生長因子(PDGF)、TGF-β等[17]。

中藥在治療糖尿病及糖尿病肝纖維化方面具有獨特的優勢。許多現代研究表明石斛合劑中大部分藥物的提取物除了有明顯的降糖作用，還可改善肝臟炎性反應，防治肝纖維化。如石斛中的石斛多糖、黃芪中的黃芪總苷，均能提高大鼠抗氧化能力，減輕肝臟炎癥反應[11-12]。五味子提取物可減輕肝細胞過氧化損傷，改善肝功能，抑制肝膠原纖維形成[13]。葛根中的葛根素可減少炎癥因子的生成，緩解炎癥因子對肝組織損傷，抗纖維化形成[14]。丹參中的丹參酮可改善肝功能、抑制星狀細胞活化，減少細胞外基質生成[15]。地龍提取物、大黃中的大黃素可抑制肝組織形狀細胞活化，發揮抗纖維化作用[16]。本研究證實石斛合劑具有降糖、改善肝功能及抗肝纖維化作用，石斛合劑干預6周后大鼠血糖及ALT、AST明顯下降，通過電鏡肝臟HE染色及免疫組化觀察，可清晰觀察到石斛合劑能抑制肝臟Ⅳ膠原纖維的合成及對肝纖維化明顯的改善作用。

NF-κB是二聚體轉錄因子，其主要調節炎癥相關功能。NF-κB通過入核與靶基因調節區中的κB序列結合而實現效用。哺乳動物的NF-κB二聚體通過2個Rel亞基的同源和異二聚體相互作用產生，分別由NF-κB1(編碼p50及前體p105)、NF-κB2(編碼P52及前體p100)、relA(編碼P65)、relB(編碼relB)及C-rel(編碼c-rel)基因表達，P65和p50二聚體通常是基因轉錄的激活因子。

通常，NF-κB二聚體與IκB(IκBα，IκBβ，IκBε)蛋白結合而以無活性狀態存在，其掩蓋核定位和NF-κB二聚體的DNA結合結構域。在各種細胞炎癥因子如TNF-α和IL家族等刺激下，NF-κB經典途徑則被激活，從而導致P65和P50二聚體在核內堆積，IκB在絲氨酸32和36位處磷酸化，這過程由IKK復合物催化。該復合物含有兩個催化亞基，IKKα和IKKβ及NF-κB調節亞基IKKγ，在經典途徑中主要由IKKβ起作用。相關研究證實，NF-κB活化與肝星狀細胞(HSC)轉化成瘢痕形成的肝肌成纖維細胞有關，這也是纖維化反應的關鍵一步。本實驗中，Wester blot檢測顯示石斛合劑能降低IKKβ、NF-κB P50、NF-κB P65蛋白表達，提示石斛合劑可降低NF-κB信號表達。因此石斛合劑的作用機制之一為減少IKKβ蛋白表達，從而降低其下游NF-κB P50、NF-κB P65蛋白的活化，抑制NF-κB信號途徑，進而抑制肝臟膠原纖維的形成，改善肝纖維化，但是石斛合劑通過降低IKKβ信號抑制NF-κB信號通路的作用及其機制仍需進一步研究。