白藜蘆醇β-環糊精包合物在大鼠體內生物利用度研究

于琛琛，張純剛，程 嵐

(遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600)

白藜蘆醇(C14H12O3)化學名稱為3，5，4′-三羥基二苯乙烯，是一種無色針狀晶體，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑[1-2]。其水溶性較差，但細胞膜通透性很高，屬于BCSⅡ類化合物[3]。白藜蘆醇在自然界的存在形式主要有2種：順式和反式白藜蘆醇[4]。白藜蘆醇的順式異構體與反式異構體均具有光敏性，在光照條件下會有部分互相轉化，故應避光保存[5]?，F已發現白藜蘆醇具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集、抗細菌和真菌感染、影響胃酸分泌、調節血脂等[6-12]。但是其水中溶解度較差，導致其體內生物利用度較低，嚴重影響了其廣泛應用。本實驗通過將白藜蘆醇制備成β-環糊精包合物，提高其水溶性，并進行了大鼠體內的藥物動力學研究，進而提高其體內生物利用度。

1 材料

高效液相色譜(島津SHIMADZU，2010A-HT)；渦旋混合器Vortex-5(IKA，Vortex 3)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠，TGL-16 g)。

白藜蘆醇原料藥(API)(98%，武漢遠成共創科技有限公司，20171225)；白藜蘆醇-β-環糊精包合物(自制，白藜蘆醇∶β-環糊精質量比=1∶2)；卡馬西平對照品(內標，上海哈靈生物科技有限公司，100142-201605)；白藜蘆醇標準品(南京森貝伽生物科技有限公司，111535-201502)；色譜甲醇和色譜乙腈(SIGMA)；醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

雄性SD大鼠12只，體質量(250± 20)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：水∶乙腈=70∶30(v/v)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：320 nm，進樣量30 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 白藜蘆醇系列對照品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇標準品適量，用甲醇溶解并定容濃度為250 μg/mL的儲備液，于4 ℃保存。臨用前，用甲醇稀釋定容，濃度分別為100、200、1 000、2 000、5 000、10 000、25 000 ng/mL的標準工作液。

2.2.2 內標液的配制 取卡馬西平標準品，用甲醇配置濃度為250 μg/mL的儲備液，于4 ℃保存。臨用前，用甲醇定容成濃度為25 μg/mL的內標工作液。

2.3 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品100 μL，置于2 mL EP管中，加入甲醇10 μL，加入內標液10 μL，加入醋酸溶液(0.5% v/v)50 μL，加入乙腈200 μL，渦旋混合3 min，離心10 min(12 000 rpm)，取上清液進樣。

2.4 給藥方案與血樣采集

將雄性SD大鼠12只隨機分成2組，給藥前不禁水，禁食12 h，一組口服灌胃原料藥(20 mg/kg)，另一組給予白藜蘆醇β-環糊精包合物(含白藜蘆醇20 mg/kg)；并于給藥后5、10、15、30、45、60、120、240、 480、720 min眼眶取血0.2 mL置于肝素化的EP管中，離心(4 000 rpm)，取上清液于-20 ℃冰凍保存備測。

2.5 方法學考察

2.5.1 方法專屬性 分別取6只雄性SD大鼠空白血漿100 μL，將加入內標溶液10 μL改為加入甲醇10 μL，其余按“2.3血漿樣預處理”項下的方法操作，得空白血漿樣品色譜圖1-A；將白藜蘆醇標準溶液和內標溶液加至空白血漿中，依同法操作，得色譜圖1-B，其中白藜蘆醇和內標(卡馬西平)的保留時間分別為3.86和7.25 min；取給藥后的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1-C。結果表明，血漿中內源性物質不干擾白藜蘆醇和內標(卡馬西平)的測定。

A.大鼠空白血漿；B.大鼠空白血漿加白藜蘆醇和內標物；C.給藥后30 min的血漿圖1 HPLC法測定血漿中白藜蘆醇(Ⅰ)和內標(Ⅱ)的典型色譜

2.5.2 標準曲線、線性關系及定量下限 配成濃度相當于10、20、100、200、500、1 000、2 500 ng/mL的白藜蘆醇血漿對照品溶液，再按“2.3”項處理后檢測，所得數據以血漿中白藜蘆醇的濃度X對白藜蘆醇與內標的峰面積比值Y進行線性回歸繪制標準曲線。得標準曲線回歸方程：y=0.005 8x+0.211 3(r=0.999 5)。結果表明，白藜蘆醇在10～2 500 ng/mL線性關系良好，最低定量為10 ng/mL。

2.5.3 方法精密度和準確度 取大鼠空白血漿100 μL，加入高、中、低3種質量濃度的標準溶液各10 μL，配制成質量濃度分別為 20.0、500.0、2 000.0 ng/mL的質量控制(QC)樣品，每一質量濃度進行6樣本分析，連續進樣3天，用隨行標準曲線測得QC樣品的質量濃度，與配制質量濃度對照，求得血漿樣品測定方法的準確度與精密度，白藜蘆醇低、中、高3個濃度的日內精密度分別為3.26%，4.60%，3.40%；日間精密度分別為4.54%，3.63%，3.98%。準確度分別為(100.0±3.26)%，(99.0±4.6)%，(97.2±3.3)%，結果表明白藜蘆醇血漿樣品測定方法的精密度和準確度符合要求。

2.5.4 提取回收率 配制低、中、高3種濃度(20.0、500.0、2 000.0 ng/mL)的白藜蘆醇血漿對照品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后檢測。另取同樣濃度的白藜蘆醇對照品各6份于試管中，不加空白血漿，按“2.3”項處理后檢測，依據標準曲線計算各自的濃度，低、中、高3種濃度的相對回收率分別為(96.6±2.6)%、(100.5±2.2)%和(99.0±4.4)%。內標卡馬西平的提取回收率為(99.6±2.5)%。

2.5.5 樣品穩定性 本實驗考察了白藜蘆醇血漿樣品室溫放置2 h、處理后進樣室溫(4 ℃)放置24 h、經歷1次和3次冷凍-解凍循環和-20 ℃冰凍30 d的穩定性。進行穩定性考察時，取空白血漿100 μL，加入白藜蘆醇低、中、高三個質量濃度的系列質量控制溶液10 μL，配制成低(20 ng/mL)、中(500 ng/mL)和高(2 000 ng/mL)的3個質量濃度的QC樣品，每一濃度進行3樣本分析。實驗結果說明白藜蘆醇血漿樣品在避光條件下室溫放置2 h、處理后進樣室溫(4 ℃)放置24 h、經歷1次和3次冷凍-解凍循環和-20 ℃冰凍30 d均可保持穩定(相對偏差均在15%之內)。數據見表1。

表1 在不同條件下白藜蘆醇樣品的穩定性

2.6 藥動結果

采用 DAS 3.0藥動學軟件處理口服白藜蘆醇原料藥和制劑的血藥質量濃度測定數據，將血藥濃度(C)與時間(t)數據用 DAS3.0擬合，測得平均血藥濃度-時間數據見圖2。主要藥動學參數見表2。

圖2 RES原料藥和RES-β-環糊精包合物在大鼠體內的藥-時曲線

表2 白藜蘆醇在大鼠體內主要藥動學參數

3 討論

根據白藜蘆醇及卡馬西平的理化性質，考察了采用甲醇、乙腈直接沉淀蛋白方法進行血漿樣品處理。由于采用甲醇進行沉淀蛋白處理血漿樣品，不能完全地除去蛋白，而采用乙腈沉淀蛋白。血漿中加入2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率較高，操作簡單、方便、效率高。最終選定加入2倍量乙腈作為沉淀試劑。

采用HPLC-UV法測定大鼠血漿中白藜蘆醇的質量濃度，經過流動相配比及選擇后確定采用乙腈∶水(30∶70)，可獲得較短的保留時間，同時又可以與雜質峰分離，樣品分析時間短，1次測定只需8.0 min，本方法定量下限為10 ng/mL，能滿足白藜蘆醇體內藥動學研究。

生物等效性統計學評價中進行Cmax和AUC的方差分析，與RES原料藥比較，白藜蘆醇-β-環糊精包合物Cmax和AUC都具有顯著性差異(P<0.05)，制劑組的Cmax和AUC都具有較明顯的提高。從表1中可以看出，RES原料藥組AUC0-t和AUC0-∞分別為(514.7±117.5)和(543.7±102.2)ng/mL*h，白藜蘆醇-β-環糊精包合物組的AUC0-t和AUC0-∞分別為(1 191.4±147.9)和(1 396.4±196.4)ng/mL*h，白藜蘆醇口服制劑與原料藥對比，其相對生物利用度為225.6%。RES原料藥組Cmax為(473.3±200.8)ng/mL，白藜蘆醇-β-環糊精包合物組為(1 135.3±60.6)ng/mL，提高了2.4倍多。與原料藥組相比，達峰時間更快。t1/2由原料藥的2.56 h延長至4.42 h。實驗結果顯示，白藜蘆醇經過β-環糊精包合后，藥物在體內的吸收具有較明顯的提高。其吸收峰濃度顯著提高，同時制備的β-環糊精包合后半衰期明顯延長，提示將白藜蘆醇制備成環糊精包合物是可以較好地提高其口服吸收。本文作者建立了 HPLC-UV法用于測定大鼠血漿中白藜蘆醇的濃度，首次報道了白藜蘆醇-β-環糊精包合物(白藜蘆醇：β-環糊精質量比=1∶2)大鼠體內的藥動學情況，為白藜蘆醇體內血藥濃度的測定和藥動學的研究提供參考依據。為了更好地評價白藜蘆醇的藥用價值，對其在體內的分布、排泄及代謝產物特點有待進一步研究。