中藥內外治結合法對糖尿病腎損害大鼠腎組織TGF-β1 的影響

董玉君，卞 鏑

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847)

2型糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)是嚴重威脅人類健康的重大疾病，而糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常見和最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是導致慢性腎衰竭甚至死亡的主要因素。其病理改變早期以腎臟肥大為特征，隨著病情的進一步發(fā)展，則會出現(xiàn)以腎小球系膜區(qū)為主的細胞外基質(Extracelluar Matrix，ECM)積聚和系膜基質增生，終致彌漫性和結節(jié)性腎小球硬化。因此，糖尿病腎損害的早期防治尤為重要。但目前，現(xiàn)代醫(yī)學除了降糖以外，延緩DN的病情發(fā)展尚無有效方法。本實驗研究旨在觀察中藥內外治結合對模型大鼠早期腎組織中TGF-β1含量的影響，探討對DN是否有積極干預作用，為臨床防治DN提供一定理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠50只，體重(250±20)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進食與活動正常。

1.2 動物飼養(yǎng)環(huán)境及飼料

遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心，室內通風及光線良好，濕溫度適宜。普通飼料配方為40%玉米面、26%白面、10%麩子等。高糖高脂飼料配方為61.5%普通飼料、10%豬油等，由沈陽前民飼料廠提供。

1.3 藥物

內服藥物(金匱腎氣丸和五子衍宗丸加減)：由熟地、山藥、附子、菟絲子、覆盆子等藥物組成，購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥局，按成人劑量的7倍，水煎濃縮至2 mL，每1 mL含生藥2 g，每日1次灌胃，4 ℃冰箱貯藏備用，1周為1個療程，連續(xù)2個療程。

外治藥物：以丁香、附子、肉桂等為主。將藥物打成粉末，用黃酒調后敷灸神闕，藥物現(xiàn)用現(xiàn)配，1周為1個療程，連續(xù)2個療程。

1.4 主要儀器及試劑

鏈脲佐菌素(STZ；美國Sigma公司)；血糖測定分析儀(強生One toughⅡ)；Western blot檢測試劑盒、蛋白質maker兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)；電泳槽、轉印槽(北京六一儀器廠)；電泳凝膠成像系統(tǒng)(美國)。

2 實驗方法

2.1 糖尿病腎損害動物模型建立

雄性Wistar大鼠50只，隨機選取10只為空白對照組，予以普通飼料，其余大鼠喂以高糖高脂飼料。喂養(yǎng)4周，造模組大鼠體重達到(340±10)g(其中有4只體重未達標者從實驗中剔除)，按50 mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液。72 h后測空腹血糖≥16.7 mmol/L且血糖穩(wěn)定，繼續(xù)喂養(yǎng)12周，并于眶靜脈取血，檢測Sur和BUN含量，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即DM腎損害大鼠造模成功(造模期間有5只大鼠死亡，3只大鼠血糖偏低剔除)。

2.2 動物分組與給藥方法

將成模的28只大鼠隨機分為模型對照組、內治組、外治組、內外治結合組，每組7只，在成模后2周進行2個療程的治療。實驗期間自由飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。內治組和內外治結合組按人體-大鼠體表面積比值換算按中等劑量4.8 kg·d-1進行灌胃。等量選取敷灸藥物用黃酒調勻，用于外治組和內外治結合組敷灸神闕。

大鼠神闕穴的定位：大鼠的腹正中線上，以劍突為一定位點，以外生殖器為另一定位點，兩者連線的上2/3與下1/3的交點(參考《實驗針灸學》)。

2.3 實驗指標的記錄與測定

2.3.1 取材 大鼠禁食不禁水12 h，檢測血糖值后用7%的水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射深麻醉后置于解剖臺上，取仰臥位，于腹部切開皮膚，剝離腹腔臟器，露出腹主動脈，行腹主動脈穿刺取血。處死大鼠后剝離并迅速摘取腎臟，濾紙吸去臟器表面血液，去除包膜，稱重，置于EP管中，冷凍保存。

2.3.2 Western blot檢測TGF-β1 取腎組織100 mg裂解離心后取每個樣本的10 μg進行凝膠電泳，將蛋白轉印至PVDF膜上，先后分別加入一抗(1∶1 000)和二抗(1∶2 000)進行孵育，滴入ECL發(fā)光液，曝光采集圖像。以β-actin為內參照，采用凝膠成像分析軟件測定各條帶灰度值，并以目的蛋白灰度值/內參條帶灰度值的比值作為TGF-β1相對表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠腎重/體重比較

模型組及各治療組大鼠腎重/體重比值與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明大鼠腎臟出現(xiàn)病理性改變。治療組大鼠腎重/體重比值與模型對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各種治療方法均有一定的效果。內治組和外治組大鼠腎重/體重比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但內外治結合組大鼠腎重/體重比值明顯優(yōu)于內治組和外治組(P<0.05)。見表1。

組別腎重/體重(×10-3)空白對照組6.93±0.35模型對照組14.58±1.58*內治組11.10±0.83*△★☆外治組11.37±1.49*△★☆內外治結合組10.37±0.83*△

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與內外治結合組比較，★P<0.05，內治組與外治組比較，☆P>0.05。

3.2 各組大鼠腎組織中TGF-β1表達情況比較

造模組大鼠TGF-β1表達水平明顯高于空白對照組(P<0.01)，模型對照組大鼠TGF-β1表達水平顯著高于各干預治療組別(P<0.01)，內治組和外治組大鼠TGF-β1表達水平比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但內外治結合組大鼠TGF-β1的表達水平明顯優(yōu)于內治組和外治組(P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達情況

組別TGF-β1空白對照組0.185±0.022模型對照組0.594±0.078*內治組0.428±0.028*△★☆外治組0.419±0.057*△★☆內外治結合組0.301±0.052*△

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與內外治結合組比較，★P<0.01，內治組與外治組比較，☆P>0.05。

4 討論

4.1 動物模型的建立

文獻[1-2]表明，STZ對胰島β細胞有選擇性破壞作用，結合高糖高脂飼料喂養(yǎng)能誘發(fā)大鼠產(chǎn)生廣泛性胰島素抵抗，且雄性大鼠制造模型的成模率明顯高于雌性大鼠。故采用該方法復制的動物模型符合人類2型DM的發(fā)病特點。3～6月齡大鼠相當于人的青春期階段，而大鼠產(chǎn)生高血糖后又進行喂養(yǎng)3個月，此時大鼠年齡相當于人的中年期[3]。經(jīng)歷了漫長的疾病階段，以方測證[4]并結合大鼠的嗜睡、倦臥、尿頻清等癥狀綜合分析，已發(fā)展為最終的腎陽虛階段。

4.2 中醫(yī)理論依據(jù)

內服藥物以金匱腎氣丸和五子衍宗丸加減而成，旨在扶正以祛邪，其中金匱腎氣丸具有補腎氣、溫腎陽的功效。方中加入少量具有溫通經(jīng)脈的桂枝等，在于取“少火生氣”之義[5-6]。五子衍宗丸為補腎益精經(jīng)典方劑，方中菟絲子補肝腎益精，覆盆子助君藥滋腎澀精。

神闕為任脈穴，位于腹中部臍中央，毗鄰脾、胃、膽、大腸和小腸等多個與飲食運化相關臟腑，脾胃又為氣機升降之樞紐。同時臍部內分布的多種植物神經(jīng)叢和神經(jīng)節(jié)，其支配著腹部盆腔內所有臟腑器官和血管[7]，因此神闕與運化食物水飲和氣機升降出入都有著緊密的聯(lián)系。臍又是母體與胎兒聯(lián)系的樞紐，同時神闕與丹田相通，所以神闕為五臟六腑之根，是先天真息潛藏的主要部位，與人體生命活動密不可分。

吳氏[8]認為內治與外治有殊途同歸之理，在上述理論的指導下，結合DN遷延日久腎陽虛損的病機特點，以具有溫補腎陽作用的附子、肉桂等藥物外敷神闕穴，藥物通過臍穴皮膚的滲透吸收進入血液，推動氣血運行，改善局部微循環(huán)。

4.3 實驗結果討論

DN發(fā)病過程中，ECM逐漸增加，與體內多種細胞因子參與有關，其中最重要的因子是致纖維化因子TGF-β1。在生理狀態(tài)下，腎臟ECM合成與降解處于動態(tài)平衡。在病理因素作用下，這種平衡被打破，其一為腎臟的ECM合成增多，其二為腎臟的ECM降解減少[7，9]。

Shankland及Nakamura[10-11]均發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎皮質中TGF-β1比正常大鼠含量高2.2～4倍。研究發(fā)現(xiàn)[12]，TGF-β1具有促進糖尿病時腎臟肥大、提高基質降解酶抑制物活性、抑制基質降解酶的合成、致ECM的積聚增加和降解減少的作用，從而促進腎小球硬化。TGF-β1的持續(xù)高度表達又可誘導包括系膜細胞在內多種細胞的基質蛋白，如IV膠原、纖維連接蛋白等。所以實驗研究從降低糖尿病腎病時期TGF-β1的表達著手，探討并尋求有效的糖尿病腎病防治方法。

本研究觀察顯示，給予一定治療方法后腎重/體重比值及TGF-β1的表達有所下降，空白對照組大鼠腎組織中TGF-β1僅微弱表達，模型對照組大鼠的TGF-β1較空白對照組有顯著提高，與以上討論結果一致。各中藥治療組能顯著降低糖尿病大鼠腎皮質TGF-β1的表達，但中藥內治組與外治組別相比較無顯著性差異，其中結合法治療組療效優(yōu)于單純藥物內服組或單純藥物外治組。由此我們推測降低TGF-β1的表達，減少腎臟細胞外基質的積聚，是中藥內外治結合法防治DN的作用機理之一。

5 結論

實驗結果顯示，應用具有溫補腎陽、扶正祛邪作用的中藥內服結合外治的治療方法可減輕腎臟肥大及腎小球基底膜增生、硬化，中藥內外治結合法能夠防治大鼠糖尿病早期腎損害。本研究為臨床應用溫補腎陽法防治糖尿病腎病提供了實驗基礎。