2"-O-沒食子酰基金絲桃苷的抗炎和神經保護活性研究

夏良萍，孫惠芳，王 丹，郭蘭芳*，湯 建

(1.江蘇大學附屬四院，江蘇 鎮江 212001；2.江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮江 212013)

金絲桃苷具有抗炎鎮痛、神經保護、抗抑郁、抗氧化、保肝、抗癌、降血糖以及保護心腦缺血損傷等藥理活性[1，2]，廣泛存在于薔薇科(如北山楂)、藤黃科(如貫葉連翹)等植物中[3]。本課題組在前期研究中發現野生植物澤漆中富含金絲桃苷及其衍生物2″-O-沒食子酰基金絲桃苷(2″-O-galloyl hyperoside，HyG)[4]。一些含有沒食子酰基片段的天然化合物(如：茶多酚)往往具有良好的抗氧化、神經保護活性[5]。因此本課題組推斷，2"-O-沒食子酰基金絲桃苷可能具有良好的抗炎、抗氧化和神經保護等方面的藥理活性。在本研究中，本課題組利用細胞模型初步評價了此化合物的抗炎和神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7，購自中國科學院上海細胞庫；PC12低分化細胞株，由江蘇大學藥學院藥理實驗室提供；HEK 293T細胞，購自美國ATCC；1640培養基和新生牛血清(NBCS)，購自維森特生物技術(南京)有限公司；DMEM培養基，購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)，購自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TRAPEZE端粒酶試劑盒，購自美國EMD millipore。2"-O-沒食子酰基金絲桃苷和對照藥物金絲桃苷為本實驗室自制，純度>95%。

1.2 主要儀器

Sartorius電子天平；臺式高速冷凍離心機(Thermo Scientific)；酶標儀(Spectra Max190，Molecular Device)；二氧化碳培養箱(Thermo Scientific)。

1.3 化合物對NO釋放的影響

參照文獻將HyG用DMSO配置成 100 mM的儲備液[6]，使用時用含10% NBCS的1640培養基稀釋至所需濃度。指數生長期的RAW 264.7細胞接種于96孔板中，5×104個/孔。待細胞狀態穩定貼壁后分別加入終濃度為0.3、3、30 μM的待測樣品，孵育24 h棄上清后每孔加入20 μL MTT工作液(5 mg/mL)，37 ℃孵育3 h。除去上清，每孔加入DMSO (100 μL)輕搖振蕩使得實驗孔底部紫色結晶溶解并均勻分布，酶標儀570 nm測得吸光度(OD值)，計算細胞存活率。

RAW 264.7細胞接種于24孔板中，4×105個/孔。待細胞狀態穩定貼壁后分別加入終濃度為0.3、3、30 μM的待測樣品，孵育12 h。棄去上清后加入150 μL的含LPS(終濃度1 μg/mL)的培養基，孵育12 h。取上清，離心，備用。

將NaNO2標品用細胞培養液梯度稀釋至0、1、2、5、10、20、40、60、100 μM，加至96孔板中，50 μL/孔。再依次加入Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，反應20 min后于酶標儀540 nm檢測吸光度(OD值)。以NaNO2濃度梯度為X軸，OD值為Y軸，得回歸方程為Y= 0.004X-0.016，r=0.997，在1～100 μM范圍內有良好的線性關系。據標準曲線計算NO濃度。

1.4 HyG對魚藤酮致PC12損傷的保護作用

參照文獻將PC12細胞接種于96孔板中[2]，細胞密度1×104個/孔；37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h。棄去上清，加入終濃度為0.1、1、10、100 μM濃度的HyG孵育5 h。加入終濃度5 μM的魚藤酮共育24 h。棄去上清，加20 μL的MTT于37 ℃孵育3 h。棄去上清，每孔加入DMSO (100 μL)輕搖振蕩使得實驗孔底部紫色結晶溶解并均勻分布，酶標儀570 nm測得吸光度，計算細胞存活率。

生長期細胞占細胞培養瓶的80%時，按照細胞密度6×103個/孔接種于96孔板中，培養基在37 ℃，5% CO2細胞培養箱條件下培養24 h。棄去上清，加入終濃度為0.3、1、3、10、30 (μg/mL)的濃度梯度的PSC孵育5 h。加入終濃度50 μM共育24 h。棄去上清，加20 μL的MTT于37℃孵育3 h。棄去上清，每孔加入DMSO (100 μL)輕搖振蕩使得實驗孔底部紫色結晶溶解并均勻分布，酶標儀570 nm測得吸光度，計算細胞存活率。

1.5 化合物對疊氮鈉致PC12損傷的保護作用

在此實驗中采用25 mM疊氮鈉(NaN3)損傷PC12細胞，其他操作同“1.4”項。

1.6 化合物對端粒酶的作用

參照文獻將HEK 293T細胞接種于12孔板中[7]，置于37 ℃，5% CO2孵箱培養48 h，吸去培養液后D-PBS洗滌，再加入胰蛋白酶消化5 min。加入DMEM培養基混勻、轉移至離心管中。400 g離心5 min，吸去上清，D-PBS洗滌。細胞中加入含有蛋白酶的裂解液，混勻后置于冰上裂解30 min，于4 ℃，12 000 g下離心20 min。上清層轉移至小離心管(10 μL/管)中，干冰/乙醇冷凍后置于-80℃冰箱內保存。TRAP實驗參照TRAPEZE?端粒酶試劑盒操作說明進行，測定HyG對端粒酶的調節活性(圖3A-D)。每個微型離心管中含有上述制備的裂解產物2 μL，藥物的終濃度分別為0.1、1、10 μM，陽性對照組為1 μL的TSR8，空白組為0.1% DMSO。

1.7 數據分析處理

本次實驗采用GraphPad Prism 7統計學軟件進行單因素和多因素變異比較分析(ANOVA)，各組數據采用平均數±標準差(mean±SD)表示。P<0.05表示差異具有統計學意義，P<0.01表示差異具有極顯著統計學意義。

2 結果

2.1 HyG對RAW264.7細胞炎癥的抑制作用

在細胞存活率實驗室中，HyG對RAW264.7細胞無明顯細胞毒活性，說明細胞培養液中NO濃度降低是基于藥物對細胞中NO釋放的抑制。本實驗中發現HyG對RAW264.7細胞中NO釋放具有一定的抑制作用，但作用強度均低于相同濃度的金絲桃苷(HyP)。

注：LPS：1 μg/mL；IND(陽性對照藥吲哚美辛)：50 μM；##P<0.01，**P<0.01。

圖1 HyP和HyG對RAW264.7細胞中NO釋放的抑制作用

2.2 HyG對PC12細胞增殖的影響

在細胞存活率實驗室中，HyG對PC12細胞的自然增殖沒有明顯的抑制作用，說明化合物HyG對PC12細胞無明顯細胞毒活性。

2.3 HyG對魚藤酮和疊氮鈉致PC12損傷的保護作用

HyG(0.3-30 μM)對疊氮鈉所致的PC12細胞損傷具有顯著的保護作用(P<0.01)，其中30 μM濃度下損傷后的PC12細胞存活率較空白對照組高10.3%，3 μM濃度下HyG的保護作用略低于金絲桃苷(HyP)。在魚藤酮致PC12細胞損傷模型中，HyG也表現出濃度依賴性的保護作用，但和模型組(Rot組)相比并未表現出顯著差異。

注：Ctrl：空白對照組；Rot：(魚藤酮)5 μM；NaN3(疊氮鈉)：10 mM；HyP(金絲桃苷)： 3 μM；##P<0.01，**P<0.01。

2.4 端粒酶活性

金絲桃苷(HyP)和HyG在0.1、1.0、10 μM濃度下，對HEK293T細胞中的端粒酶具有一定程度的抑制作用，相對端粒酶活性分別降低12.0%、12.9%、22.6%(圖3C)和-1.7%、27.6%、49.4%(圖3D)。

注：DMSO：0.1%DMSO；△H：95 ℃加熱20 min。

3 討論

HyG具有一定程度的抗炎活性，但和金絲桃苷相比并未表現出優勢。HyG對疊氮鈉損傷的PC12細胞具有顯著保護作用，但在3 μM濃度下HyG作用強度略低于金絲桃苷，對魚藤酮損傷的PC12細胞損傷不敏感。端粒酶激活是細胞壽命延長和保護的重要機制之一，但與預期的結果相反，HyG和對照藥金絲桃苷對HEK293T細胞中的端粒酶具有一定程度的抑制作用。可見，HyG的神經保護活性不是基于對端粒酶的激活作用，可能與其他方面的機制，如抗氧化應激等有關。在后續的工作中還需要進一步的研究來闡明HyG的神經保護作用機制。