UPLC法分析人參在儲存不當情況下對皂苷類成分的影響

張詩雯，張 凡*，高 慧，曹麗娟，姜恒麗

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.盛實百草藥業有限公司，天津 300301)

中藥在中醫治療中起著重要作用，而不當的貯藏與養護則會影響中藥的藥效[1]。中藥在不當的貯藏過程中，如受不當的溫度、濕度、光線、藥材自身含水量、包裝方式等因素的影響，容易發生一系列質變過程[2-3]。隨著中藥材市場規模的日益擴大，中藥材正確的貯藏與養護變得十分關鍵，以便其充分發揮藥效以及避免發生安全問題[4]。人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根莖，味甘、微苦，微溫，歸脾、肺、心、腎經，可大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養血、安神益智[5]。人參作為我國的名貴中藥材，在臨床中被廣泛應用，但其用量不大且貯存周期長，不當的儲存方法會導致人參發生霉變、酸敗等現象，進而影響其主要活性成分人參皂苷的含量[6]。因此本實驗采用超高效液相色譜的方法，檢測人參皂苷Rg1、Re、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量變化，為人參的質量控制提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WGL-125B電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；X/WT數顯調節儀電熱恒溫水浴鍋(余姚市顯星儀器有限公司)；Milli-Q型超純水制備儀(美國Millipore公司)；Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.2 材料

生曬參、鮮人參均購自于吉林白山林村盛實百草人參種植基地；人參皂苷Rg1(A0503AS)、人參皂苷Re(S0317AS)、人參皂苷Ro(F0214AS)、人參皂苷Rb1(D0718AS)、人參皂苷Rc(O0303AS)、人參皂苷Rb2(J0322AS)、人參皂苷Rd(D0105AS)，均購于美倫生物有限公司；乙腈、甲醇均為色譜級；其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 供試樣品制備

2.1.1 霉變人參制備 取未洗的鮮人參適量，不經冷藏直接放置于室溫環境一段時間，直至鮮人參表面有白色絨毛斑點生成，每隔7日取出一批霉變的鮮人參，共4批。

2.1.2 酸敗生曬參制備 取生曬參適量，用濕抹布包裹，放置于室溫環境，放置一段時間后，聞到有酸敗氣味產生，每隔7日取出一批，共4批。

2.1.3 返軟生曬參制備 取生曬參適量，用水浸泡至生曬參變軟，取出。

2.1.4 鮮人參 取適量鮮人參，洗凈。

2.1.5 生曬參 取適量生曬參，備用。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2與人參皂苷Rd對照品適量，用30%乙腈定容，得到濃度分別為0.212 mg·mL-1，0.226 mg·mL-1，0.264 mg·mL-1，0.220 mg·mL-1，0.272 mg·mL-1，0.260 mg·mL-1，0.288 mg·mL-1的對照品溶液。搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品溶液制備[7]

取鮮人參、霉變人參、酸敗生曬參以及返軟生曬參適量切成碎末，分別精密稱取2.5 g；生曬參打粉，過4號篩，精密稱取1.0 g，各供試樣品分別用80%甲醇50 mL冷浸提取5次，每次12 h，40 ℃下濃縮提取液至干，用30%乙腈溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻放置，用前以0.45 μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，4 ℃下低溫儲藏。

2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，檢測波長：203 nm，流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，流速：0.4 mL/min；進樣量：4 μL。梯度洗脫見表1，色譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序

A.人參皂苷混合對照品；B.人參供試品

(1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Ro；4.人參皂苷Rb1；5.人參皂苷Rc；6.人參皂苷Rb2；7.人參皂苷Rd)

圖1 人參皂苷混合對照品及人參供試品色譜

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下人參皂苷混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 μL，按照“2.4”項下色譜條件測定，以對照品進樣質量為橫坐標(x，μg)，峰面積(y)為縱坐標，以外標曲線法，進行線性回歸計算。結果表明，各對照品進樣量與峰面積在所選定的進樣量范圍內呈現良好的線性關系，結果見表2。

表2 人參皂苷各對照品線性關系

2.5.2 精密度試驗 按照“2.4”項下色譜條件，連續6次吸取混合對照品溶液進超高效液相。實驗結果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd的峰面積積分RSD值依次為1.83%、1.33%、1.48%、1.85%、1.44%、1.48%、1.42%。說明該儀器精密度較好。

2.5.3 穩定性試驗 按照“2.4”項下色譜條件，精密吸取同一種樣品溶液，于放置0、2、4、8、12、24 h后進樣，結果表明人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd峰面積積分RSD依次為1.96%、1.67%、1.52%、1.54%、1.78%、1.56%、1.42%。說明樣品溶液中的7種成分在24 h內穩定。

2.5.4 重復性試驗 同時取出樣品6份，每一份精密稱取2.5 g，按照“2.3”項下制成樣品溶液，按照“2.4”項下方法測定，得到人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd含量RSD值依次為1.50%、2.56%、2.40%、2.31%、2.34%、2.53%、2.11%。結果表明該方法重復性較好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取生曬參粉末0.5 g，共9份，分為3組，精密加入低、中、高三個質量濃度的7個對照品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項下色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9。

表3 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗

表4 人參皂苷Re加樣回收率試驗

表5 人參皂苷Ro加樣回收率試驗

表6 人參皂苷Rb1加樣回收率試驗

表7 人參皂苷Rc加樣回收率試驗

表8 人參皂苷Rb2加樣回收率試驗

表9 人參皂苷Rd加樣回收率試驗

2.6 含量測定

精密稱取生曬參供試品1.0 g，其余各供試品2.5 g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件測定，記錄7種人參皂苷的峰面積，計算7種人參皂苷的含量。

3 結果

對各人參樣品進行測定，得到人參皂苷含量結果，見表10、表11。7種人參皂苷含量變化趨勢見圖2。結果顯示，霉變人參相較于鮮人參，7種人參皂苷含量呈現上升趨勢；酸敗生曬參、返軟生曬參相較于生曬參，7種人參皂苷含量顯著下降，其中酸敗生曬參下降趨勢尤其明顯。

表10 鮮人參及不同程度霉變程度鮮人參中7種人參皂苷含量 (mg/g)

表11 生曬參、返軟生曬參及不同酸敗程度生曬參中7種人參皂苷含量 (mg/g)

圖2 7種人參皂苷含量趨勢變化

4 討論

本實驗研究發現，當人參發生霉變時，人參皂苷的含量相較于正常鮮人參的含量有所升高。但鮮人參在不當的溫度與濕度環境下會引起霉變反應，會導致有毒有害物質產生，對人體產生危害。因此即使在皂苷含量升高的情況上，也應該避免在儲存過程中發生霉變。我們可以在人參栽培過程中控制適當的溫度以及濕度來使鮮人參中的人參皂苷含量保持相對較高的水平，以保證人參的藥效。

在生曬參與返軟生曬參以及酸敗程度不同的生曬參的對比中，生曬參相較于另外兩種貯存不當的生曬參來說，7種人參皂苷含量總和有明顯下降趨勢，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re以及人參皂苷Rb1的含量大幅度降低；且酸敗類型生曬參的人參皂苷含量明顯低于返軟類型生曬參。隨著酸敗程度的不斷加深，人參皂苷的含量逐漸下降。上述實驗結果表明，將生曬參儲藏在濕度過高或濕度與溫度均過高的環境下，會導致生曬參發生返軟和酸敗現象，使其中人參皂苷含量明顯降低。因此在儲藏過程中應該避免將生曬參放置于濕度與溫度過高的環境中，這樣可以使生曬參保持最高的人參皂苷含量，發揮最好的藥效，也可避免在變質過程中產生有毒有害成分。

人參作為我國珍貴的中藥材越來越受人們重視，隨著其栽培與加工技術的不斷發展，人參在人們日常生活與臨床中得到廣泛應用。不正確儲藏人參的方式會導致其有效活性成分人參皂苷的含量下降或產生有毒有害成分，使人參不能正確地發揮其滋補強壯以及預防治療疾病的功效[8]。因此，應該對儲藏人參的溫度、濕度等環境條件進行強化管理，這樣可以避免人參發生質變，從而影響其藥材質量[9]。