Box-Behnken響應面法優(yōu)化燙狗脊炮制工藝

李 丹，王小康，吳建偉，張志超，劉江紅

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 藥學部，廣東 深圳 518110)

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根莖，其主要成分為酚酸類、黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油及多糖[1-2]。現代藥理學研究表明狗脊具有抗骨質疏松、抑菌抗炎、抗風濕、抗氧化及保肝等多種藥理活性[3-6]。狗脊具有祛風濕、補肝腎、強腰膝多種功效，臨床主要用于風濕痹痛、腰膝酸軟、下肢無力等癥的治療[7]。《中藥炮制經驗集成》一書記載，狗脊的炮制方法主要有酒蒸、炒焦、砂燙、土炒、酒炒、酒砂炒、鹽水煮等[8]。燙狗脊為2015年版《中國藥典》狗脊項下唯一收載的炮制品，但是目前鮮見對燙狗脊炮制規(guī)范的研究報道。在已報道的文獻中存在關鍵炮制工藝參數尚不明確等問題，如砂量比、砂燙時間、砂燙溫度等，并且炮制工藝參數在不同文獻中也有很大差異[9-10]，不利于燙狗脊的規(guī)范化生產。因此，本研究以燙狗脊中原兒茶酸的含量為評價指標，采用單因素考察結合Box-Behnken響應面設計的方法對燙狗脊的炮制工藝進行研究，為規(guī)范燙狗脊的炮制工藝提供科學依據。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Milli-Q Direct超純水儀(默克股份有限公司)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ5000-DE超聲波清洗儀(昆山儀器股份有限公司)；乙腈、冰乙酸(默克股份有限公司，色譜純)；水為超純水；甲醇試劑為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)；原兒茶酸對照品(批號2 110753-201817)，狗脊藥材采自廣東省肇慶市，由深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院藥學部劉江紅副主任藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根莖，用于燙狗脊的炮制研究。

2 方法與結果

2.1 原兒茶酸的定量分析方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-1%冰乙酸(5∶95)進行等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取原兒茶酸對照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，用甲醇-1%冰乙酸(70∶30)配制成質量濃度為534.86 g·mL-1的對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液適量，置于容量瓶中，加甲醇-1%冰乙酸(70∶30)配制成質量濃度分別為267.43、133.72、66.86、33.43、16.71 g·mL-1的系列對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 取“2.1.2”項下系列對照品溶液，按“2.1.1”項下的條件進行測定，以質量濃度C(g·mL-1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，計算原兒茶酸的線性回歸方程。結果顯示，回歸方程為Y=985.18X+931.25，r=0.999 5，表明原兒茶酸在16.71～534.86 g·mL-1的濃度范圍內呈良好的線性關系，見圖1。

2.2.2 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液1份，按照“2.1.1”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示原兒茶酸峰面積RSD為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批燙狗脊樣品，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣測定，計算原兒茶酸的含量。結果顯示原兒茶酸的含量RSD為0.75%，表明該方法的重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批燙狗脊供試品溶液，分別于 放置0、3、6、9、18、24 h后，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣測定，結果顯示原兒茶酸的峰面積RSD為0.65%，表明供試品溶液在24 h內的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的燙狗脊樣品3份，每份 0.5 g，分別按供試品中原兒茶酸含量的50%、100%、150%精密加入對照品，每個質量濃度平行測定3份，按“2.1.3”項下方法分別制備供試溶液，再按照“2.1.1”色譜條件進樣測定。根據標準曲線計算各成分的含量，并計算加樣回收率。結果顯示原兒茶酸的平均加樣回收率為96.45%，RSD為1.01%，表明本方法加樣回收率良好。

圖1 原兒茶酸的標準曲線

a.原兒茶酸

2.3 單因素試驗

2.3.1 不同砂量比 準確稱取狗脊藥材6份，每份50 g，固定其他條件，考察砂量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1對原兒茶酸含量的影響。砂量比的大小將會影響藥材的均勻受熱，因此最終會影響藥材的炮制質量。由圖3可以發(fā)現，當砂量倍數為4∶1時，原兒茶酸的含量達到最大，然而隨著砂量比的增大，原兒茶酸的含量趨于飽和。

圖3 砂量比對原兒茶酸含量的影響(n=3)

2.3.2 不同砂燙時間 準確稱取狗脊藥材5份，每份50 g，固定其他條件，考察砂燙時間2、4、6、8、10 min對原兒茶酸含量的影響。由圖4可以發(fā)現，砂燙6 min時原兒茶酸的含量達到最大，隨著砂燙時間的增加，原兒茶酸的含量反而有減小的趨勢。這可能是隨著炮制時間的增加，炮制品斷面顏色逐漸加深出現焦糊，導致有效成分碳化分解[11]。

圖4 砂燙時間對原兒茶酸含量的影響(n=3)

2.3.3 不同砂燙溫度 準確稱取狗脊藥材5份，每份50 g，固定其他條件，考察砂燙溫度150、180、210、240、270、300 ℃對原兒茶酸含量的影響。由圖5可以發(fā)現，當溫度為210 ℃時原兒茶酸的含量達到最大，隨著溫度的增加，原兒茶酸的含量反而減小。推測為隨著溫度的升高，炮制品容易焦化，導致有效成分碳化分解[11]。

圖5 砂燙溫度對原兒茶酸含量的影響(n=3)

2.4 Box-Behnken響應面法優(yōu)化試驗設計

2.4.1 建立模型及方差分析 為了得到燙狗脊的最佳炮制工藝參數，繼續(xù)采用Box-Behnken響應面法對單因素考察結果再進一步優(yōu)化。以砂量比(A)、砂燙時間(B)和砂燙溫度(C)作為自變量，選取3個水平(0，±1)建立模型對燙狗脊的炮制工藝進行優(yōu)化，實驗因素及水平設計見表1，試驗結果見表2。

表1 Box-Behnken設計因素及水平

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

續(xù)表2 Box-Behnken實驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

注：**P<0.01，差異顯著；*P<0.05，差異顯著。

2.5 最優(yōu)炮制工藝預測及驗證試驗

根據建立二次回歸方程模型及響應面圖，預測到燙狗脊的最佳炮制工藝為砂量比4.67∶1、砂燙時間為5.87 min、砂燙溫度177.99 ℃，預測原兒茶酸的含量為0.931 mg/g。考慮到實際操作，炮制工藝調整為砂量比4.5∶1、砂燙時間為6 min和砂燙溫度180 ℃，其中預測的砂燙溫度在2015版《中國藥典》四部通則推薦的溫度范圍之內，證明該優(yōu)化條件的合理性。此外，根據以上條件進行3次炮制工藝平行驗證，原兒茶酸的含量分別為0.941 mg/g、0.949 mg/g、0.952 mg/g，含量均值為0.947 mg/g，RSD為0.66%。實測值與預測值基本一致，偏差率小于1%，說明所建立模型基本可靠。

圖6 砂量比(A)、砂燙時間(B)和砂燙溫度(C)對原兒茶酸含量(Y)交互作用響應面

3 結論

2015年版《中國藥典》以原兒茶酸作為燙狗脊的含量測定指標。本研究前期實驗發(fā)現炮制過程中燙狗脊原兒茶酸的含量主要受砂量比、砂燙時間、砂燙溫度的影響較大，各因素之間對原兒茶酸的含量也存在著交叉影響。砂燙時間過久或溫度過高均會引起炮制品碳化，導致有效成分分解，說明尋找合理的炮制參數是非常關鍵的。因此，本研究通過Box-Behnken響應面法對單因素考察結果進一步優(yōu)化，所建立模型總決定系數r2=0.982 1，模型擬合度高并且能解釋98.21%的試驗數據變異性，可以較好地預測燙狗脊原兒茶酸與砂燙溫度、砂燙時間、砂燙溫度之間的變化關系。各因素對原兒茶酸含量的影響順序為：砂燙時間>砂燙溫度>砂量比。根據模型預測到燙狗脊的最優(yōu)炮制工藝為砂量比4.67∶1、砂燙時間為5.87 min、砂燙溫度177.99 ℃，預測原兒茶酸的含量為0.931 mg/g。通過實驗進一步驗證設計方案的可靠性，實測值與預測值的偏差率較小，建立模型基本可靠，可為規(guī)范燙狗脊的炮制工藝提供更多的科學依據。